离子交换层析课程讲义

离子交换层析第一节概述

离子交换层析（ionexchangechromatography）,是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法，这种层析方式称为离子交换层析。离子交换层析在无机化合物、有机化合物和生物大分子的分离中应用最早、最广泛的方法之一。它既可用于大规模工业化生产，也可用于销量制备或研究分析。

离子交换层析介质是在一种高分子的不溶性固体(载体)上引入具有活性的离子交换基团，即阳离子交换基团或阴离子交换基团，这些基团与溶液中相同电荷的基团进行交换反应。在一定的pH环境中，不同物质的解离度不同，分子或离子的带电性的强弱不一样，与离子交换基团的交换能力也不同。因此，物质通过离子交换层析可以得到相应的分离。

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第二节离子交换层析原理

一、离子交换剂的交换作用

当溶液中存在着A、B两种或两种以上的离子，并通过离子交换层析柱时，原来吸附在离子交换介质上的离子与溶液中高浓度的A、B离子发生交换作用，脱离离子交换介质，游离在流动相中，并随流动相流出来。由于A、B两种离子在同一溶液中的解离度不同，它们所带的净电荷有差异。因此，二者在层析柱内的迁移速度不同。从上样的起始点(原点)至A、B两离子的层析峰间的距离逐渐加大，最终完全分离。

在一定情况下，吸附在离子交换介质上离子的量与溶液中游离离子的量达到平衡时，二者物质的质量之比，称为分配系数或平衡常数，以Kd表示。

3Kd=Ms／Mi

式中Ms——单位质量的离子交换介质的摩尔数量；

Mi——单位体积溶液中溶质的摩尔数量。

从理论上讲，凡是溶液中离子间的Kd值有差异，通过离子交换层析均可分开。但实际工作要受到诸多因素的影响，离子的分配系数不仅与电荷有关，而且受到其他因素的制约。分离的条件与样品与介质的基本性质及缓冲液的组成有密切的关系。

4二、离子交换介质的排斥和阻滞作用

离子交换介质的排斥和阻滞作用是指离子排斥电离物质或电离程度不同的物质，将带有不同电荷离子或离子化合物分离。如在层析柱内装有阳离子交换介质，当一种含有阳离子A+的缓冲液通过该层析柱时，使该层析柱处于完全离子化的溶液中，然后将一种含有不同阳离子B+溶液通过层析柱时，那么介质上有一部分A+就会被B+所取代，直至2种离子达到平衡。

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两种离子达到平衡时，相对组成取决于介质—O-—A+的浓度、溶液中B+离子的浓度以及离子交换介质对A+和B+的相对亲和力。随着含B+的溶液从层析柱中上流出来，B+完全有可能结合到离子交换介质上。如果在缓冲液的pH值、离子强度、柱温、流速等条件很合适的情况下，结合在层析介质上的组分就会以一个很窄的区带流出，得到高浓度的洗脱峰6

从柱上洗脱阳离子B+，需要采用不同的缓冲液，开始用氢离子浓度较低的缓冲液，然后在该缓冲液中逐渐增加氢离子浓度以取代吸附在柱上的B+离子。或在同一种pH值的缓冲液中增加离子强度。另一种情况，在相同的pH值和离子强度的缓冲液中加入一种比离子交换层析介质亲和力更强的阳离子来取代吸附在柱上的B+离子。

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如果要分离纯化一种具有兼性离子特性的生物大分子，其离子化的程度取决于它所在溶液中的净电荷。生物分子带电荷与否，或带什么样的电荷，主要决定于溶液的pH值。溶液的pH值高于生物大分子的等电点时，就带负电荷，解离成负离子；低于生物大分子的等电点时，就带正电荷，解离成阳离子。因此，分离具有兼性离子的生物大分子，要对溶液的pH值、生物大分子的等电点和离子交换层析介质三种条件同时进行考虑。8第三节离子交换层析介质

离子交换介质主要由惰性载体和交换基团两部分组成。载体是由高分子化合物聚合而成的球形颗粒或多糖类化合物交联而成的球形颗粒，离子交换基团一般都是由容易解离的酸根基团或碱性基团组成。（一）载体离子交换介质的载体(或称为母体)的基本性质，应当具有良好的亲水性、水不溶性、较好的化学稳定性和较多的容易被活化剂活化基团。亲水性是为了让合成的介质更容易与溶液中的离子接触，发生交换作用；化学稳定性，是为了让介质不易与溶液中的溶质发生化学反应，有利于离子交换基团与溶液中的离子发生可逆性的交换作用。

9（二）载体的分类离子交换介质的载体有很多种，但归纳起来主要有两类。一类是化学原料合成载体，如聚苯乙烯树脂等；另一类是天然材料制成的载体，如琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶，纤维素粉等。目前用得较多的载体有聚苯乙烯树脂系列(polyphenylethylene)、纤维素粉系列(cellulose)、葡聚糖凝胶系列(sephadex)、琼脂糖凝胶系列(sepharose)、灌注微珠(perfusion)等。10（三）离子交换基团的性质离子交换基团主要是酸性离子基团，也称之为阳离子交换基团；碱性离子基团，也称之为阴离子交换基团。离子交换基团在溶液中吸附相反的离子，该离子可以与被分离的物质发生可逆性的交换作用。（四）离子交换基团的分类根据离子交换基团的酸、碱性质可以分为以下几类。强酸型阳离子交换基团(如磺酸基)、中强酸型阳离子交换基团(如磷酸基)、弱酸阳离子交换基团(如羧酸基)、强碱型阴离子交换基团(如季胺基)、弱碱型阴离子交换基团(如伯胺基)。常用离子交换基团见表1。

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表1常用的离子交换基团12类型名称缩写结构阳离子乙基磺酸基SE-O-CH2-CH2-S03-甲基磺酸基SM-O-CH2-S03-磷酸基P-O-PO3-羧甲基CM-O-CH2COO-阴离子三乙基氨基乙基TEAE-O-CH2-CH2-N+-(-CH2CH3)3二乙基氨基乙基DEAE-O-CH2-CH2-N+H-(-CH2CH3)2氨基乙基AE-O-CH2-CH2-N+H3（五）交换基团的交换反应式

阳离子交换基团:

磺酸基：一R—SO3-H++Na+

一R—SO3-Na++H+

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第四节常用的离子交换层析介质及其特性

（一）聚苯乙烯树脂离于交换介质

AmberliteIR-120，Dowex-50(Sigma公司产品)；Zerolit-225，Zerokarb-225(英国生产)；树脂201X8，732，734(国产)。

以聚苯乙烯树脂为载体合成的离子交换介质的特点是刚性强，流速快，效率高，适于小分子强离子型化合物的分离。

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14（二）纤维素离子交换介质

DATE-Sephacel，QAE-Sephacel(Sigma公司生产)；DEAE-Sephacel(Phamarcia公司

生产);DEAE-纤维素-(DE32)、DEAE-纤维素—(DE52)(国产)。

以纤维素粉为载体合成的离子交换介质的特点是具有较好的亲水性，对生物大分子或

有机小分子均可进行分离，介质价格便宜，适合于规模化生产.1515

（三）葡聚糖凝胶离子交换介质

QAE-SephadexA25、DEAE-SephadexA25、CM-SephadexC25(Phamarcia公司生产)；

DEAE-葡聚糖、CM-葡聚糖(国产)。

以葡聚糖凝胶为载体合成的离子交换介质的特点是具有较好的亲水性和凝胶网状结

构，适用于生物大分子化合物的分离

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16（四）琼脂糖凝胶离予交换介质

Q—Sepharose-4BFF、Q-Sepharose-6BFF、DEAE-Sepharose-4BFF-4B、DEAE—Sepharose-6BFF、CM-Sepharose-4BFF、CM-Sepharose-6BFF、SP-Sepharose-4BFF、SP-Sepharose-6BFF(Phamarcia公司生产)；DEAE-QT4、CM-QT4(国产)。

以琼脂糖凝胶为载体合成的离子交换介质的特点是具有较好的亲水性、凝胶网状结构的大孔性、刚性好、能耐受一定的操作压、流速快，分辨率高、非特异性吸附少等。适用于生物大分子的分离，可用于大规模的分离纯化。1717

第五节离子交换介质的技术指标

（一）交换容量及其表示方法

交换容量是离子交换层析介质的一个重要参数，介质的交换容量越大，介质的性能越好，分离的效率越高。交换容量是表示在单位质量或单位体积的离子交换介质中所能交换溶液中溶质的质量。固体离子交换介质交换容量的表示方法：每克介质交换溶质的毫克数量或毫摩尔数量(mg／g或mmol／g)；浸泡在溶液中或溶胀好的离子交换介质交换容量的表示方法：每毫升介质交换溶质的毫克数或毫摩尔数量(mg／ml或mmol／m1).

18(二)交换容量的测定的方法

交换容量的测定方法有很多种，不同性能的介质有不同的测定方法，但是通常的测定方法是以酸、碱滴定法来确定强酸型或强碱性离子交换介质的交换容量，或者通过吸附某一特定的生物大分子的质量来确定弱酸型或弱碱性离子交换介质的交换容量。具体测定方法如下。19

1．强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法

取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用lmol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性，lmol／L的HCl处理，去离子水洗至中性。然后用lmol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的NaOH滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。计算公式如下。

202．强碱型阴离子交换介质容量的测定方法

取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用1mol／L的HCl处理，去离子水洗至中性，lmol／L的NaOH处理，去离子水洗至中性。然后用lmol／L的NaCl洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的HCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如下。213．凝胶类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换

介质容量的测定方法

取一定量的离子交换介质，漂洗干净(若是固体介质，用去离子水溶胀)，用lmol／L的NaCl处理，去离子水洗无机盐，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和(流人柱的蛋白浓度与流出液的蛋白浓度相等时，即为介质的吸附量已达到饱和)。一定浓度的NaCI或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，计算出蛋白质的质量，除以离子交换介质的总质量或总体积，即可得到交换容量。计算公式如下。22

（三）溶胀系数

大多数离子交换介质都是以干燥的小圆珠或粉末状保存的，在使用之前需要经过溶胀。溶胀系数是指每克干的离子交换介质吸附水后膨胀的体积，用ml／g表示。介质溶胀体积的大小与否取决于载体交联度的大小，如Sepharose4BFF表示1g干胶溶胀后能获得5ml凝胶介质，其溶胀系数为5。

23（四）介质粒度

介质粒度是指离子交换介质颗粒直径的大小，单位是μm。常用的离子交换介质的粒度大小可分为4类，即：

粗：颗粒直径在100—500μm左右，可用较大规模制备。

中粗：颗粒直径在50～150μm左右，小型制备兼分析。

中细：颗粒直径在20—80μm左右，用于分析。

细：颗粒直径在5—30μm左右，微量分析，HPLC。24（五）理化性质

刚性指介质耐受外界压力的程度，即在较高的操作压下介质不变形，柱床体积保持稳定。

物理稳定性对热的耐受程度，在较高的温度下交联度不发生改变。

化学稳定性一般是指在0．5一lmol／L的强酸或强碱溶液中或高浓度的盐溶液中，化学性质保持稳定，化学键不发生断裂或降解反应，并具有较强的抗氧化的能力。25

第六节离子交换层析技术

（一）离子交换层析介质的选择

在液相层析分离中，选用阳离子交换层析介质还是阴离子交换层析介质，主要取决于被分离物质所在溶液中的解离度及解离后离子所带电荷的性质(正电荷或负电荷)。如果是正离子应当选用阳离子层析介质，负离子选用阴离子层析介质。选择的基本原则如下。

261．已知被分离物质等电点若已知被分离样品的等电点，则参照它所在缓冲液的pH值，首先看缓冲液的pH值比被分离物质的等电点高还是低，若缓冲液的pH值比被分离物质的等电点低，被分离物质就带正电荷，应当选择阳离子交换介质。若缓冲液的pH值比被分离物质的等电点高，被分离物质就带负电荷，应当选择阴离子交换介质。例如，一个样品的等电点为5．0，如果在pH7．0缓冲液中，被分离物质带负电荷，选择阴离子交换介质；如果在pH4．0缓冲液中，被分离物质带正电荷，选择阳离子交换介质。27

由此可以看出，凡是缓冲液的pH值高于样品等电点，应选择阴离子交换介质；低于样品的等电点，应选择阳离子交换介质。

对于生物大分子而言，被分离物质的等电点与缓冲液的pH值之间的差别至少要在一个pH值以上。二者之间的差异越大，分子带的净电荷越多，越有利于进行离子交换层析分离。

282．未知被分离物质的等电点对于未知等电点的样品，由于不知道被分离物质在溶液中带何种电荷，是正离子还是负离子，就无法选择何种离子交换介质为好，在这种情况下首先应做一个预试验。取若干支试管，加入等量的阴离子交换介质或阳离子交换介质，依次加入不同pH的缓冲液，再加入等量的待测样品，混匀后检查每一支试管上清液中待测样品被吸附量的变化。若在某一支试管中的样品恰好完全被吸附，该管就是在此pH环境中的离子交换介质，如图1所示。29

不同pH的缓冲液介质吸附样品的变化从图1可以看出，在选定的离子交换介质的情况下，在pH6．0的缓冲溶液样品中要分离的离子化合物被介质完全吸附。因此，就可以确定在pH6.0以上的缓冲溶液中选择阴离子或阳离子介质。这种简单的试验，可提供参考。一般情况，试验阴离子交换介质，用pH5.0～9.0的缓冲液；阳离子交换介质，用pH3.0—8.0的缓冲液为宜。303．吸附的差异取两支试管分别加入等量的同一缓冲液，一支加入等量的阴离子交换介质，另一支加入等量的阳离子交换介质。在相同的pH值条件下吸附被分离样品，然后测定两支试管吸附样的量，根据介质对样品吸附的量做出判断。测试结果一般有三种可能性。31

第一，样品可以被阴离子交换介质吸附，阳离子交换介质不吸附，可选择阴离子交换介质；第二，样品可以被阳离子交换介质吸附，阴离子交换介质不吸附，可选择阳离子交换介质；第三，阴离子或阳离子两种交换介质均不吸附或吸附量很少。这种现象有两种原因：①可能是样品的等电点处于缓冲液的pH值附近，样品解离度很低，在溶液中不带电荷，不能生成离子化合物，离子交换介质与样品无法进行离子交换反应。32

为了避免出现这种情况，最好选择偏酸或偏碱的缓冲液来进行试验，如可以用pH4.0的酸性缓冲液或pH9.0的碱性缓冲液。②该样品可能是一种非离子型化合物，像糖类化合物。这类样品不适于用离子交换层析方法进行分离。33（二）缓冲溶液的选择离子交换层析的缓冲液来源很广，凡是由弱酸和强碱、强酸和弱碱、弱酸和弱碱组成；的溶液，并具有一定缓冲容量均可以作为缓冲液。但是不同的化学试剂配成的缓冲液其缓冲能力是有差异的。选择缓冲溶液的出发点，主要是围绕有利于被分离物质的分离和稳定，有利于与再次纯化所用的缓冲液的衔接，有利于从分离的样液中除去缓冲离子等方面进行综合考虑。缓冲溶液主要包括缓冲液的浓度、缓冲容量、pH值、离子强度和保护剂等。

341．缓冲容量缓冲容量与缓冲液的浓度有密切关系。一般情况，在缓冲容量满足的前提下，缓冲液的浓度尽量降低，因为高浓度的缓冲液浓度对正相离子交换层析的吸附能力具有抑制作用。

2．pH值缓冲溶液的pH值最少要高于或低于被分离物质等电点1个pH单位，最好应尽量远离样品的等电点，有利于样品的解离，形成离子化合物。

353．离子强度离子强度在保证样品稳定的前提下，尽可能采用低离子强度，有利于样品在上述过程中发生离子交换反应，提高交换率。

4．保护剂某些特殊的样品在溶液中不稳定，需要在溶液中加入一定的稳定剂，盐类、糖类、抗氧化剂类或尿素等，以保护样品的原有的性质。36

（三）缓冲液选择的原则

1．有利于样品的稳定离子交换层析的某些洗脱液是蛋白质的变性剂，或者是蛋白样品的强洗脱剂，如盐酸胍、尿素、三氯乙酸、有机溶剂等。上述溶液一般不适用作蛋白质和酶的洗脱剂，但可以作为离子交换介质的处理再生之用。因此，在选择缓冲液时，尽量避免使用强洗脱剂和不利于样品的化学性质和生物活性稳定的缓冲液。

372．有利于样品的吸附和洗脱选择的缓冲液既要有利于介质与溶质发生离子交换作用，又要有利于样品从离子交换柱上洗脱下来。如果选择的缓冲液极容易吸附，非常难洗脱，或者容易洗脱，吸附量很低这都是不可取。

3．有利于分样品后处理从离子交换层析柱分离得到的组分，一般纯度不是很高，还需要用其他的方法进行再次分离纯化，或浓度较低，需要进行去盐，浓缩干燥等。选择的缓冲液要有利于样品的后处理。离子交换层析所用的缓冲液尽量与再次纯化所用的缓冲液一致。

384．考虑缓冲液是否有毒性避免使用毒性较大的缓冲液，如巴比妥，乙腈等。尤其是在食品工业和制药工业，使用了有毒性的缓冲液，产品的质量将会受到影响。

5．考虑是否有热源在制药工业，选用的缓冲液或缓冲液的添加剂尽量避免使用易引起热源的化学药品，如果确实需要使用有热源的化学药物，可选择容易除去的化合物。39（四）上样及洗脱方式

1.上样

上样量上样量一般是根据离子交换介质的交换容量来确定，通常上样量不超过交换容量的10％～20％。尤其是对比较稀少或比较珍贵的样品一定严格控制上样量，在上样前要进行必要的计算。具体计算方法如下。

W=V×E

式中W——表示上样量，单位是mg或mmol；

V——柱床体积，ml;

E——介质的交换容量，mg／ml或mmol／ml。

40②样液浓度离子交换层析需要的样液浓度不宜过高，如果样液浓度过高，溶液黏度大，层析时传质速度慢，不利于溶液中的离子与离子交换介质进行交换，部分溶质还未来得及交换就流出柱外，造成回收率下降。对浓度较高的样液，最好先用缓冲液进行适当的稀释后再上样。41

③离子强度样液的离子强度不能过高，离子强度会影响介质对溶质的吸附，但有利于抑制杂质的吸附。对某些样品与介质的结合能力较强离子，可以采用较高离子强度的缓冲溶液上样；对某些样品与介质的结合能力较弱离子，可以采用低离子强度的缓冲溶液上样。

42④流速如何控制离子交换层析上样过程中的流速，主要取决于样品的浓度、溶液黏度、样品的解离度及分子量的大小。对浓度较高、黏度较大、解离度低、分子量大的溶液，要低流速上样；对浓度较低、黏度较小、解离度低分子量小的溶液，要高流速上样。否则会造成离子交换层析的收率低或效率差。上述几种因素中，浓度影响最大，所以对浓度低的样液流速可快一些，缩短上样时间；对浓度高的样液流速可慢一些，有利于进行离子交换。·432.洗脱方式离子交换层析的洗脱方式主要有一步洗脱法、分步洗脱法和梯度洗脱法。

①一步洗脱实验室常用的洗脱方式，它是指用一种浓度的洗脱剂进行洗脱。这种洗脱方法是只针对离子交换柱吸附的组分比较单一或者被分离的组分非常明确，对其基本性比较了解，吸附的量占主要部分，采取的洗脱方式。如图2所示。4445

②分步洗脱在离子交换柱中吸附着两种以上的组分，并且离子交换介质对这些组分的吸附能力有较大的差异，在洗脱时采用不同浓度的洗脱剂或采用不同种类的洗脱剂进行洗脱。这种洗脱方法适用于吸附数量较少、分离度差别较大的组分。如图3所示。

③梯度洗脱在离子交换柱中吸附着多种组分，并且离子交换介质对这些组分的吸附能力具有一定的差异，在洗脱时采用浓度连续变化的洗脱剂进行洗脱。这种洗脱方法适用于吸附数量较多、分度差别较小、用上述两种方法难以分离的组分洗脱。梯度洗脱方式有4种，梯度溶液的制备方法和洗脱曲线如图4(a)一(d)所示。46473.洗脱剂离子交换层析的洗脱剂有很多。实验室常用的洗脱剂有酸、碱和盐溶液等。改变整个系统的酸碱度和离子强度，可以使结合在离子交换柱上组分的交换性能发生变化，当洗脱液中的离子强度大于结合在离子交换柱上的组分或柱内的酸碱度发生改变直至越过其等电点(流出液从酸性变成碱性或从碱性变成酸性)时，该组分就会逐步被洗脱下来。

梯度洗脱的形式主要有离子强度梯度洗脱、pH梯度洗脱、(离子强度+pH)混合梯度洗脱。48

第七节洗脱曲线的分析

（一）洗脱峰变小

离子交换层析是一种比较成熟的分离技术，在不改变分离条件的情况下一般都具有较好的重复性，每次分离的结果的保留值差别不大。但随着离子交换柱使用的次数增加，柱内介质的交换容量会不断下降，洗脱峰变得一次比一次小，上样时流出液中有效组分的含量逐渐增多，这就预示着离子交换介质需要进行再生和处理了。

49（二）洗脱峰部分重叠

在离子交换层析分离过程中，相邻的洗脱峰常出现部分重叠现象，原因是多方面的。但主要有以下几种可能性：

①相邻两组分的性质相近，在现有的条件下不可能将它们完全分开。这种情况需要重新建立离子交换分离系统，包括重新选择离子交换介质、缓冲系统和洗脱剂。50②离子强度或酸碱度太大，在洗脱过程中由于离子强度过高或溶液的酸碱度变化太大，导致洗脱速度过快，第一个组分从柱上还未完全洗脱下来，第二个组分就开始洗脱了，因此出现重叠峰。这种情况，可以适当地降低洗脱液中的离子强度或减缓溶液酸碱度的变化，降低梯度洗脱曲线的斜率或更换洗脱剂即可。如图5所示。51（三）洗脱峰拖尾

在离子交换层析分离过程中，洗脱峰出现拖尾现象或者两峰之间相距较远，出现这种现象的主要原因是洗脱液中的离子强度偏低或梯度洗脱曲线的斜率偏低。这种情况，可以适当增加洗脱液的离子强度、提高洗脱曲线的斜率或采用混合梯度洗脱即可。如图6所示。52

第八节影响离子交换层析的因素

（一）离子交换介质的影响

离子交换层析介质孔径与被分离物质的相对分子质量大小直接影响到层析柱的分离度和柱容量，尤其在凝胶类离子交换层析介质和生物大分子的分离中影响更为明显。

(1)凝胶孔径对分离度的影响在离子交换层析过程中，被分离组分在柱中的保留值主要受离子交换介质表面的静电效应和大孔径的凝胶载体的分子筛效应的影响。53

在排阻层析中大孔径的凝胶介质能够使溶质产生不同的内在渗透作用，在生物大分子的相对分子质量接近于凝胶孔径的大小时就会受到严格的限制。这种作用直接阻碍了生物大分子在离子交换介质和流动相中的传质速度，产生分子筛效应，使分离效果下降。实验证明30～50nm的孔径以上的介质可以分离相对分子质量大于100000的蛋白质，因此，大孔径的凝胶介质或实心球类介质对生物大分子的分离结果影响较小。54

(2)凝胶孔径对柱容量的影响离子交换层分离的过程是离子交换介质表面与溶液中离子直接作用的结果。柱容量与介质的表面积成正比，确切地说，对于生物大分子而言不是全部的表面积，而是能与生物大分子发生作用的有效表面积。一般选择的介质应当对分离的生物大分子是有较大的表面积。有效表面积A可以用以下公式表示。

A=Ao+KAi

式中Ao——离子交换介质柱床颗粒外表层面积；

K——表面系数，表示在层析过程中对离子发生作用的有效面积的分数

Ai——柱床颗粒内孔表面积。

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分子的大小和种类不同K值也不同，当相对分子质量的大小接近于凝胶孔径的大小时，K值趋于0。如牛血清清蛋白，在25—30nm孔径的介质上KAi值较大，柱容量较高，一般可达100mg／g；而相对分子质量较小的蛋白质如碳酸酐酶在10nm孔径的介质上就可获得较高的柱容量；相对分子质量较大的蛋白质如免疫球蛋白则需要50—100nm孔径的介质上才能获得较高的柱容量。56（二）离子交换柱长度的影响

离子交换柱的长短对蛋白质的分离影响不是很明显，如一支柱床高度为25cm和5cm的离子交换柱对蛋白质的分离没有多大差异。因此，离子交换柱一般都选用短粗的层析柱，柱长容易造成分子筛效应，使保留值延长，引起洗脱峰的扩散，出现重叠现象。使用短柱优点是洗脱体积相对比较集中，相应的浓度比较高，容易提高检测灵敏度，柱的负载少，操作压小，有利于提高流速。

（三）缓冲溶液的影响

缓冲溶液的影响包括溶液的pH值、缓冲容量、离子强度等因素。571．pH值影响对弱电解质和两性解离的生物大分子，在离子交换层析分离技术是通过调节缓冲液的pH值来控制样品的解离度或所带电荷的性质及净电荷量。例如在分离蛋白质时，缓冲液的pH值高于蛋白质的pI带负电荷；低于蛋白质的pI带正电荷。所以缓冲液的pH值可以决定蛋白质带什么样的电荷，决定选择什么样的离子交换介质。如果缓冲液的pH值选择不当，将会给整个分离系统带来负面效应，如吸附率差、回收率低、杂质多等。

582．缓冲容量