第十四章 超敏反应性疾病的免疫学检验

超敏反应性疾病的免疫学检验张思英病原学教研室

超敏反应：已经致敏的机体再次接受相同抗原刺激后，所引起的以生理功能紊乱或组织损伤为主的异常的适应性免疫应答。第一节激发试验激发试验（provocationtest）

是模拟自然发病条件，用少量超敏原引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定超敏原的一种体内试验。

非特异性激发：是用组胺等刺激物做雾化吸入，以观察患者对Ⅰ型超敏反应的敏感性，进而分析病因或判定疗效。特异性激发：是用抗原如尘螨等做试验，对明确超敏原有一定价值。

用于Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应性疾病的检查。收集原料粉碎、匀浆脱脂、提取过滤、分离鉴定分装、保存清毒试验部位抗原的制备皮试前臂曲侧、上臂、背部禁忌：皮肤患湿疹、感染、皮炎或外伤正在或近日服用免疫抑制剂或抗组胺药物皮肤试验的类型与方法皮内试验（intracutaneoustest）；挑刺试验（pricktest）主要用于Ⅰ型超敏反应斑贴试验（patchtest）主要是检测Ⅳ型超敏反应0.01～0.03ml/针相同超敏原不同稀释度速发型15～30min内观察迟发型48～72h内观察4mm/针方法结果一、皮肤试验---皮内试验速发型皮肤试验的结果判定标准分级

皮内试验

点刺试验-无风团或小于阴性对照无风团反应或小于阴性对照+风团3～5mm、红晕＜20mm无风团,阴性对照＜红晕≤20mm++风团6～9mm伴红晕无风团，红晕＞20mm+++风团10～15mm伴红晕风团伴红晕++++风团＞15mm伴红晕和伪足风团伴红晕和伪足迟发型皮试结果判定标准反应程度

结果判定-无反应或小于阴性对照+仅有红肿++红肿伴硬结+++红肿、硬结、小疱++++大疱或/和溃疡

比皮内试验敏感性稍低，但假阳性较少；皮试液浓度要比皮内试验高10～100倍。将试验抗原与对照液分别滴于试验部位的皮肤上用针尖透过液滴轻挑一下以刺破皮肤而不出血为度1min后拭（吸）去试验抗原液一、皮肤试验---点刺试验速发型皮肤试验的结果判定标准分级

皮内试验

点刺试验-无风团或小于阴性对照无风团反应或小于阴性对照+风团3～5mm、红晕＜20mm无风团,阴性对照＜红晕≤20mm++风团6～9mm伴红晕无风团，红晕＞20mm+++风团10～15mm伴红晕风团伴红晕++++风团＞15mm伴红晕和伪足风团伴红晕和伪足皮内试验较点刺试验有更好的敏感性第一次读：48小时打开斑试器,间隔30min待斑试器压痕消失后判定结果。第二次读：第3天或第4天。如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给予紫外线照射，操作过程相似。一、皮肤试验---斑贴试验迟发型皮试结果判定标准反应程度

结果判定-无反应或小于阴性对照+仅有红肿++红肿伴硬结+++红肿、硬结、小疱++++大疱或/和溃疡假阴性出现的常见原因：

①皮试液的浓度过低或失效；②老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后；③皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂；④操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。结果分析及注意事项结果分析及注意事项假阳性出现的常见原因：

①皮试液含有非特异性刺激物；②患者患有皮肤划痕征；③操作手法较重；④注入量较大或浓度过高；⑤注入少量空气等。询问病史阳性对照必备抢救药品和设施如何避免假性结果的出现：适应证阴性对照皮试液浓度皮肤试验的应用预防药物或疫苗等过敏防治Ⅰ型超敏反应性疾病结核菌素试验评估机体细胞免疫功能预防皮肤接触过敏

结核菌素试验是用结核菌素进行皮肤试验，通过观察局部是否出现迟发型超敏反应，判断机体有无结核分枝杆菌感染和对该菌的免疫力。阳性：机体已感染过结核杆菌或BCG接种成功；强阳性：可能有活动性结核病；阴性：机体未感染过结核分枝杆菌，但应考虑：①感染初期；②老年人；③重度结核病患者，机体处于免疫反应低下状态；④患有其他疾病。

结核菌素试验手捏式雾化器二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）雾化抗原颗粒≤5微米测定肺功能指标：用力肺活量(FVC)1秒用力呼气容积(FEV1)最大呼气流速(PEF)比气道传导率(sGaw)射流雾化器二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）测基础肺功能激发物稀释液：低浓度/小剂量→双倍浓度/剂量递增阳性伴明显气促、喘息口吸入1～1分半钟测定肺功能阳性标准/明显不适/临床症状直至激发物达到最高浓度阴性反应支气管舒张剂吸入二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。每次观察不能小于24小时。FEV1：重复性好，结果稳定；PEF：峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制，与FEV1有较好的相关性，适合流行病学调查；sGaw：敏感性好，但重复性稍差。测定指标二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）结果判断：

变应原的确定常以定性试验判断结果。①阳性：气道反应性增高

FEV1、PEF较基础下降≥20％或sGaw下降≥35%，有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。定性判断二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）结果判断：

②阴性：气道反应性正常

FEV1、PEF或sGaw＜上述标准，正常值为阴性。无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔2～3周后复检或2个月后再测。

受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况下一般不适宜作激发试验；有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触等。禁忌证二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）注意事项及禁忌症：受试者在检查前：48小时：停！抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素类药;12小时：停！支气管扩张剂;15分钟：实验室休息,病史、体检排除BPT的禁忌证。注意事项二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）注意事项及禁忌症：③①②④⑤⑥有一定的危险性，但较皮肤试验的特异性高与受试者的病史、症状和体征相关性较强确定支气管哮喘的过敏原，尤其皮试结果不肯定时排除皮试时的假阳性反应和假阴性反应检测新制剂的抗原性、平喘药疗效及观察脱敏效果缺点是每次仅能用一种抗原，要专门设备和技术，并需对病人进行训练并与之配合二、支气管激发试验（bronchialprovocativetest,BPT）应用与评价：观察症状症状好转或减轻导致基础饮食吃可疑的过敏食物症状加重1周后疑似过敏原，重复3次确定某食物为过敏原症状未减轻1周后排除食物所致过敏三、食物激发试验口腔激发试验将超敏原直接与口腔黏膜接触，当口腔黏膜出现肿胀和充血时，可判断为阳性反应。

结膜激发试验将超敏原滴于一眼，阳性反应为结膜充血、水肿、分泌增加、搔痒，甚至眼睑红肿。注意假阳性对结果的干扰。鼻黏膜激发试验将抗原吸入/滴入受试者鼻腔，出现鼻黏膜水肿、苍白、鼻痒、流涕、喷嚏为阳性。

四、其他方法结果判定及分析

Ⅰ型超敏反应

抗原刺激后20～30min内观察结果。

阳性反应：

点刺试验以红晕为主皮内试验以风团为主结果判定及分析Ⅳ型超敏反应接触抗原后48～72h内观察结果。

阳性反应：

皮内试验以红肿和硬结为主斑贴试验以红肿和水疱为主假性结果

假阴性：①试验抗原浓度过低或因各种原因失效；②正服用免疫抑制剂或抗组胺药物；③操作误差；④皮试季节选择不当。假阳性：①试验抗原不纯，引起交叉反应；②试验溶液配制不当，产生非特异性刺激；③皮肤反应性过强；④操作不当。

第二节

IgE的检测一、血清总IgE的检测√ELISA双抗体夹心法：操作简便，敏感性很高，是测定血清IgE最常用的方法。√CLIA：敏感度更高，特异性高，定量。

临床意义：正常人群血清IgE水平受地域环境、种族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、测定法及取样等影响，结果有一定差异。

参考值0.1～0.9mg/L某些过敏体质者高于正常1000～10000倍血清IgE高特应症、支气管肺曲菌病、药物性间质性肺炎、麻风、寄生虫病及IgE型骨髓瘤等一、血清总IgE的检测总IgE：正常成人血清含量为20～200IU/ml

婴儿血中IgE含量极低；寄生虫感染时可显著增高。sIgE:ECP(嗜酸性细胞阳离子蛋白）：放射免疫吸附剂试验

（radioimmunosorbenttest，IRST）酶联免疫测定法(ELISA)

化学发光固相荧光免疫分析一、血清总IgE的检测临床意义

：1、正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响2、IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。

一、血清总IgE的检测√酶联免疫吸附试验（ELISA）：常用间接法。√免疫印迹技术（IBT）：操作简单，能一次性测定多种变应原的特异性IgE，故临床已普遍采用IBT法。二、特异性IgE的检测（+）YYYYYYYEYEYEYYYYEYEYE洗涤洗涤洗涤结果ELISA间接法检测特异性IgE特异性变应原加入待检血清转印至NC膜NC膜待检血清特异性IgE抗-IgE·HRP底物特异性抗原条带显色NC膜—变应原—特异性IgE—抗-IgE·HRPIBT检测特异性IgE目前公认的检测I型超敏反应方法之一；具有特异性强、敏感性高；影响因素少、对患者绝对安全等优点；过敏性哮喘诊断；寻找变应原。缺点：费用昂贵、花费时间长、不同试剂盒的参比血清不同不易相互比较。二、特异性IgE的检测第三节免疫复合物检测抗原特异性循环免疫复合物利用免疫复合物中抗原特异性来测IC。优点：特异性高；缺点：需制备专一的针对抗原的抗体，只能检测特定的一种IC，不常用。（免疫复合物中的抗原性质不太清楚或非常复杂）抗原非特异性免疫复合物检测

不考虑免疫复合物中抗原的性质，只检测免疫复合物的总量。根据检测原理不同，检测技术分为：

1.物理法－PEG法2.补体法－C1q结合试验3.抗球蛋白法－mRF固相抑制试验4.细胞法－Raji细胞试验CIC：分子量600kDa以上，沉降系数＞19S；热聚合人IgG(heatagglutinationhumanIgG,HAHG)：作为参考标准品，绘制标准曲线进行CIC定量或测定A值代表CIC相当于HAHG的含量。一、抗原非特异性CIC检测技术一、抗原非特异性CIC检测技术CIC的检测方法：按抗体分子在结合抗原后发生的物理学和生物学特性的改变而设计。①PEG比浊法;②ELISA法;③细胞法——Raji细胞法;④抗球蛋白技术—mRF凝胶扩散试验。一、抗原非特异性CIC检测技术PEG比浊法：1.基本原理聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）为不带电荷、直链大分子结构的多糖，有强脱水作用，利用2%～4%浓度的PEG可选择性沉淀大分子CIC。2.技术要点生物化学检验。3.注意事项：

①2%PEG沉淀大分子CIC；②4%PEG沉淀较小分子CIC；③超过5%PEG选择性沉淀CIC的特性消失；④温度影响极大，需进行温差校正；⑤低密度脂蛋白使浊度增加，空腹采血；⑥高γ球蛋白血症和标本反复冻融浊度增加。一、抗原非特异性CIC检测技术PEG比浊法：一、抗原非特异性CIC检测技术ELISA法：1.基本原理ELISA法测定的CIC，是能够结合C1q的

IgG类抗体与其特异性抗原形成的CIC。2.技术要点将聚苯乙烯包被上C1q，加入受检血清，

CIC中IgG的Fc段与C1q结合，再加抗人IgG·HRP，形成C1q-CIC-抗人IgG·HRP复合物，加底物显色。一、抗原非特异性CIC检测技术①灵敏度高于PEG比浊法，检测到0.1mg/L，重复性好等优点；②C1q制品不易精制,纯品不稳定，只能检出与补体结合的CIC。ELISA法：一、抗原非特异性CIC检测技术细胞法-Raji细胞法：1.基本原理Raji细胞是从Burkitt淋巴瘤分离建株似B细胞系，在体外繁殖传代，细胞表面有高密度的C1q、C3b、C3d等补体受体，而且不易脱落。2.技术要点将一定量待检血清、HAHG和Raji细胞混合，使补体、CIC或HAHG与Raji细胞形成复合物，加入抗人IgG·FIC，形成Raji细胞—补体—CIC(或HAHG)—抗人IgG·FIC复合物，检测荧光强度。一、抗原非特异性CIC检测技术细胞法-Raji细胞法：3.影响因素①培养条件能改变Raji细胞其表面受体的数量及亲和性，影响检测敏感性;②待检血清中如有抗淋巴细胞的抗体，能和Raji细胞反应;③SLE血清中的抗DNA也能和Raji细胞反应，使测定结果偏高。一、抗原非特异性CIC检测技术细胞法-Raji细胞法：4.方法评价①敏感性高(6mg/LHAHG)，实用性强；②缺点需培养Raji细胞和同位素标记抗人IgG，操作繁琐;③Raii细胞培养较困难，不易长期稳定保持其特性，培养条件受限。一、抗原非特异性CIC检测技术细胞法-Raji细胞法：1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。一、抗原非特异性CIC检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。一、抗原非特异性CIC检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：2.技术要点将mRF和待检血清中的CIC在琼脂凝胶中扩散，mRF—CIC结合形成沉淀现象，进行CIC定性或定量。一、抗原非特异性CIC检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：3.方法评价敏感度较低100mg/L（HAHG），mRF来源受限，操作费时，难于常规应用。一、抗原非特异性CIC检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：CIC检测方法的基本原理及敏感性比较方法原理

敏感性(mg/LHAHG)PEG比浊法溶解度20超速离心分子大小-分子超滤分子大小-凝胶过滤分子大小30ELISA法结合C1q0.1C1q液相法结合C1q10C1q偏离试验结合C1q1～5抗补体实验固定补体0.1mRF凝胶扩散法结合RF100mRF固相抑制法结合RF1～20抗抗体法结合Ig2～3Raji细胞法补体受体6花环抑制试验补体受体10自身免疫性疾病病程中连续动态观察或辅助诊断：①试验方法本身不完善；②IC形成的复杂性，如在生理状态下IC是由各种抗原与相应抗体所构成的，维持动态平衡。在病理状态下往往是单一种类IC增高，而此种单一成分增高发展到足以影响IC总体水平情况下，才能被试验检出。二、CIC检测方法评价及应用检测方法评价：①肾脏疾病：急性肾小球肾炎、移植肾、IgA肾病；②消化系统疾病：慢活肝炎、原发性胆淤性肝硬化；③皮肤病：荨麻疹、天疱疮、皮疹性皮炎；④Ⅲ型超敏反应性疾病：SLE、RA、硬皮症、自身免疫性溶血性贫血等。此外，CIC的检测对于肿瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神经肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病的诊断。二、CIC检测方法评价及应用临床应用：

固定或沉积于病变局部组织中的IC测定常用免疫组化技术，如荧光免疫组化技术检测到组织标本有Ig和补体。受累组织的成分、构型和特定的部位可为疾病的严重程度和预后提供依据。三、沉积于组织中IC的测定第四节抗球蛋白试验（Coombs试验）类型不完全抗体：抗体分子较短小，只能与颗粒抗原一方相结合，不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。抗人球蛋白试验（antiglobulintest,AGT）：将人球蛋白注入异种动物，诱导动物产生抗人球蛋白血清（antiglobulinserum，AGS)，AGS加入表面结合有不完全抗体的红细胞复合物中，就能出现可见的凝集现象。作用：检测红细胞表面结合的不完全抗体。临床意义：新生儿溶血症和自身