第三章蛋白质的分子设计修改

蛋白质分子设计第一节分子设计概况第二节基于天然蛋白质结构的分子设计第三节全新蛋白质设计第四节计算蛋白质设计第五节基于结构的药物分子设计随着理论化学方法六十年来不断发展，加上近年来计算机技术突飞猛进，分子设计已经从炼金术士的梦想走上实际的研究和应用。世界最大的二十家药厂无一例外地运用分子设计的方法把药物筛选的范围缩小到原先的1/5到1/10。从电子结构出发，设计具有特殊性质的新材料、新化合物也开始走向现实。分子设计也称为分子建模(MolecularModeling)，目前已经成为有的外国大学化学系的课程。它包括理论化学方法和计算机化学方法。理论化学方法包括量子化学、统计热力学和非平衡统计力学等。第一节分子设计概况Molecularmodelingisatechniqueforderiving,representingandmanipulatingthestructuresandreactionsofmolecules,andthosepropertiesthataredependentonthesethreedimensionalstructures.

■MolecularModeling的基本定义第一节分子设计概况“moleculargraphics“(分子制图法)or”molecularvisualizations”(分子造影术)“computationalchemistry”(计算化学)“computationalquantumchemistry”(计算量子化学)“theoreticalchemistry”(理论化学)“molecularsimulation”relatestheuseofmolecularmodelingtechniquestodescribingandunderstandingthestatisticalbehaviorandpropertiesofmoleculesona“macroscopic”scale.(分子模拟)“Moleculardynamics”dealswiththosetime-dependentpropertiesofmolecules,andusesmanyofthetechniquesofmoleculemodelingandstatisticalmechanics(统计力学).■MolecularModeling的别称第一节分子设计概况■AdvantagesofComputerModels第一节分子设计概况Geometricallyaccurate(onlylimitedbyknowledge)CapableofprecisemanipulationConformationalenergiesmaybecalculatedReadilysuperimposed(compareconformations,properties,volumes,etc)(容易叠加)Onemoleculemaybepositionedpreciselywithrespecttoasetofspacialrequirements(enzyme-substrate,activatedcomplex,etc)Easilyandconvenientlystored,edited,andduplicated■Typicalmodelingexercisescouldinvolve:

第一节分子设计概况Predictionandvisualizationofshape/propertiesComparisonofshape/propertiesExamination/predictionofmolecularinteractionsandreactionsInvestigationofunstableorexcitedmoleculesModelingofdynamicsystems(vibrations振动

diffusion扩散,conformationalchanges,reactions)■分子设计常用软件第一节分子设计概况免费显示软件Rasmol,Resinhttp:///ck化学分子显示及分子力学计算PCModelanonymousftp:under:/pub/software/PCModel分子设计软件包Tinker–Softwaretoolsformoleculardesign

http:///tinker/Java-basedon-linebiomolecularmodelingpackage–Bhttp:///~nwhite/Biomer■ApplicationsofModeling第一节分子设计概况

NewdrugsChemicalsensorsandprobesChromatographicagents色谱分析试剂

Enzymes/Catalysts

Stereoselectivesynthesis立体选择合成

PesticidesMicroelectronicsAdvancedmaterials…………■小结第一节分子设计概况分子设计历史计算化学(量子化学,分子力学等)结构化学(晶体学，谱学等)计算机技术(计算数学，软硬件，数据库，图形学等)分子设计应用领域药物设计(有机分子，多肽等)材料设计(固体，表面，晶体，高分子等)生物大分子设计(酶，蛋白质等)其它(有机反应合成路线等)★分子设计只是一种工具，它不能代替实验手段，更不能取代科学家的思考。比如一个科学家要设计一种具有新的催化性质的酶，他必须了解催化过程及机理；了解蛋白质的结构化学、生物化学等多方面的知识。因此蛋白质设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密结合。

蛋白质分子设计■蛋白质设计（即蛋白质的结构、功能预测）及结构与功能关系的研究非常必要

蛋白质是一类非常有用的物质与化学试剂相比，蛋白质的分子量非常巨大，大多数不能通过化学方法生产专一性很强是蛋白质一大优点，但因此其应用范围却受到影响分子生物学的发展克服了上述缺点。特别是定位突变及PCR使得蛋白质可能工程化，但用随机方法从事蛋白质工程研究的效率非常低

它涉及材料科学、化学、生物学、物理及计算机科学等。蛋白质设计涉及药物、食品工业用酶、污水处理、化学合成、疫苗、生物传感器等，设计的蛋白质不仅限于22种天然氨基酸，也可以包括非天然氨基酸以及有机/无机模板等。■蛋白质设计是多学科的交叉领域蛋白质分子设计■蛋白质设计的目的一是为蛋白质工程提供指导性信息；二是探索蛋白质的折叠机理。蛋白质设计分为基于天然蛋白质结构的分子设计及全新蛋白质设计或蛋白质从头设计(proteindenovodesign）。设计的蛋白质与天然蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性。所有设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级结构及合理的热力学稳定性，但一般说来它们三级结构的确定性较差■蛋白质设计目前存在的问题

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计即使蛋白质的三维结构已知，选择一个合适的突变体依然困难，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。

★1.蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程绝对必要

目前PDB(ProteinDataBank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，则需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。

■一、概述●在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选●筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等

●专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键

●计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程至关重要

●在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环

★2.蛋白质分子设计流程第二节基于天然蛋白质结构的分子设计第二节基于天然蛋白质结构的分子设计★3.蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都至关重要如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法，如下表所示。该表至今仍有重要的参考价值。

◆蛋白质设计的目标及解决办法

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计①从天然蛋白质的三维结构出发（实验测定或预测），利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。这是非常关键的步骤，一般应注意几个问题。②利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构。③预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构功能或结构稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质。

在上述设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新的蛋白质。注意★4.蛋白质突变体的设计步骤第二节基于天然蛋白质结构的分子设计a应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括带有特殊扭角的氨基酸（例如cis-脯氨酸、带正的的甘氨酸或天冬氨酸）、盐桥、密堆积区等。b应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功能关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上来考虑。c应该考察剩余位置对所希望改变的影响。d当进行互换或插入/删除残基时应考虑它们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等。同时也应考虑它们对蛋白质功能的影响。互换或插入删除区域一般都在外环。有如下一些假设：氨基酸侧链的改变不会影响核主链折叠的改变，插入删除某些部分不会影响表面区域，侧链交换遵守蛋白质结构保守原则。★4.

蛋白质突变体的设计

返回第二节基于天然蛋白质结构的分子设计①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数清况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。一个非常简单和有用的关于蛋白质折叠的假设是，假定蛋白质独特的折叠形式主要是由蛋白质内核中残基的相互作用所决定。②所有蛋白质内部都是密堆积（很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体），并且没有重叠。这个限制是由两个因素造成的。第一个因素是分子是从内部排出的，这是总疏水效应的一部分；第二个因素是由原子间的伦敦色散力所引起的，是由于短吸引力的优化。■二、蛋白质设计原理

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计③所有内部的氢键都是最大满足的（主链及侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所替代。随着溶剂键的断裂所带来的能量损失是由折叠状态的重组以及可能释放一个结合的水分子而引起的熵的增益来弥补。

④疏水与亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面与不可及表面。这种分布代表了疏水效应的主要驱动力。这种分布的正确设计不是简单地使暴露残基亲水、使埋藏残基疏水。至少有两种原因使图像复杂化。首先，侧链不总是完全地亲水，例如赖氨酸有一个带电的胺基，但是连接到主链上的碳原子是疏水的。因此在建模过程中要在原子水平上区分侧链为疏水及亲水部分。第二，正确的分布是要安排少许疏水基团在表面，少许亲水基团在内部。■二、蛋白质设计原理

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计⑤在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。这要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。⑥对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用很重要。大部分配基含有多于一个与金属作用或形成氢键的基团。如果一个功能基团与金属结合，另几个功能基团可以自由地采取其他的相互作用方式。例如，组氨酸中的咪唑可以与Nε或者Nδ成键，另外可以形成氢键。总结金属蛋白的结构表明，这些第二基团总是参与围绕金属中心的氢键网络。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用，有时也参与同侧链或水分子的相互作用。(这些相互作用起到两个作用。第一、符合蛋白质折叠的热力学要求；第二、这些氢键固定在空间的配位位置。)

■二、蛋白质设计原理

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计⑦最优的氨基酸侧链几何排列。蛋白质中侧链构象是由空间两个立体因素所决定。首先侧链构象是由旋转每条链的立体势垒所决定，其择优构象可以通过实验统计测量，也可以由第一原理计算得到。第二个因素是由氨基酸在结构中的位置所决定。蛋白质内部的密堆积表明在折叠状态侧链构象只能采取一种合适的构象，即一种能量最低的构象。⑧结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。实践表明这是蛋白质设计最困难的问题。要构筑一个蛋白质模型必须满足所有的合适的几何要求，同时满足蛋白质折叠的几何限制。因为蛋白质是一个复杂的体系，体系有可能采取一个能量与所希望状态相近的另外一个构象。因此在设计程序中必须引入一个特征，它稳定所希望的状态，而不稳定不希望的状态，这也是最困难的计算机模拟技术之一。■二、蛋白质设计原理

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计蛋白质的序列、三维结构，热力学及功能性质之间的关系是目前广泛关注的热点。它对于蛋白质工程及蛋白质设计都非常重要。这方面的研究有助于基于序列和三维结构信息预测蛋白质的功能以及序列的改变如何影响蛋白质的功能，增加设计具有预定结构与功能的蛋白质的能力。对蛋白质结构与功能的认识过程始于蛋白质中重要功能残基及蛋白质与其他分子相互作用的确定。通过定位突变替换单独的氨基酸残基是分析功能残基的有力工具。选择突变残基，最重要的信息来自结构特征。

■三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计定位突变可以在蛋白质中引入特殊的替代氨基酸并显示蛋白质功能的损失及变化。因此它是鉴定蛋白质功能残基的重要手段。对于蛋白质中某些已经通过结构及生物化学实验证明其功能重要性的残基，通过定位突变可以探测它们的作用机理。这些研究为认识蛋白质-蛋白质相互作用及酶催化的本质提供理论基础，也为蛋白质工程及蛋白质设计提供依据。蛋白质结构与功能关系研究也可用于药物开发。根据上述目的，可以进行3类突变：插入一个或多个氨基酸残基，删除一个或多个氨基酸残基，替换或取代一个或多个氨基酸残基。最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。

■三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计对于三维结构已经经过X射线测定或NMR谱测定的蛋白质，可以根据氨基酸来推测专一性残基的功能作用。如果蛋白质与它们的抑制剂、辅酶及受体的三维结构是已知的话，这个方法就更有价值。可以根据蛋白质上的氨基酸与配件上的受体基团间的距离与取向决定它们之间形成的氢键、离子对或疏水相互作用。这样的残基通过定位突变取代后，能够证实某一残基对键合过程的参与以及每一个相互作用对复合物结构的贡献。这样的研究是认识专一性及酶催化的基础。这种分析方法的一个例子是酪氨酰-tRNA

合成酶的分析。

■三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

★1.根据结构信息确定残基的突变第二节基于天然蛋白质结构的分子设计在酪氨酰tRNA合成酶中Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，当其被结构相似的Ser(19)所取代后，酶的活性降低，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。此后高分辨率的酶结合酪氨酰腺苷酸晶体结构表明在酶与底物之间可能存在11条氢键。每个氢键基团都经过突变实验证实了它们对于催化功能的贡献。

■三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

★1.根据结构信息确定残基的突变第二节基于天然蛋白质结构的分子设计随着克隆基因数据库的增加，根据与其他蛋白质的序列对比确定蛋白质中的功能域已成为可能。每个残基所起作用的信息能够来自不同种同源蛋白的序列比较或一类具有相应活性的蛋白质的序列比较。同源蛋白质的保守残基是保持那类蛋白质共同的功能或者是维持共同结构的关键因素。相反，在一类蛋白质内变化的残基对结构及功能不重要，但涉及在分子识别中起作用的专一性。这两个假设已经用于指导位点突变分析蛋白质。三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

★2.利用蛋白质同源性鉴定功能残基

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计随机突变、删除分析以及连接片段扫描突变(linkerscanningmutagenesis)等实验方法可用于鉴定功能残基。随机突变技术分析蛋白质功能的优点是用一种简单方法就可产生突变体。然而，因为对于突变没有控制，因此必须进行大规模的突变产生大量的可解释的数据。一个通过随机突变分析基因序列的例子是HIV-1蛋白酶。蛋白酶的99个残基的编码区的每个残基用不同的氨基酸替换，得到33个突变体，平均每个残基有3.3个替代物。如图2-5。

三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究★3.其他实验方法鉴定功能残基

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计82位置缬氨酸被疏水残基(Ile,Leu,Phe)或小的中性残基(Ala,Thr)的取代对蛋白质的功能没有产生有害的影响，而非保守残基(Asp或Gly)的置换没有可容忍性。又如基于位置9的脯氨酸用Thr、His及Arg替代没有可容忍性，说明它是重要的。用Ser(典型的保守残基)替代对活性没有影响，说明这个位置结构灵敏而不涉及蛋白酶的活性。三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究★3.其他实验方法鉴定功能残基

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计删除分析以及连接片段扫描突变是另一个鉴定功能残基的重要方法。这些突变涉及在整个基因位置删除或插入小数目的核苷酸，可以通过重组DNA技术构建。利用能识别序列内的多重位点的限制酶部分降解基因，并分离得到在单一位点被切断的线性片段。为了进行分散插入小的DNA片段，常常合成一个有限位点的片段(linkers)，可以把它配位到断开位置。为了建立分散删除，在重新配位形成之前用外核酸酶降解DNA，目标是快速扫描编码序列的长度以及鉴定重要功能区域，然后可以进行单一氨基酸替换的更仔细分析。这两种技术已经非常成功地用于确定在基因调控区域的DNA序列单元。这些方法也可用于蛋白质的分析。三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究★3.其他实验方法鉴定功能残基第二节基于天然蛋白质结构的分子设计这些技术在描绘蛋白质功能域的边界以及决定整个多功能蛋白质域的结构非常有效。例如HIV逆转录酶p66亚单元，它可分为p51和p15两个更小的亚单元，用连接插入突变分析p66亚单元。扫描删除分析曾用于鉴定鼠和人的粒状白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重要活性区域。GM-CSF的功能是刺激造血细胞的增殖。通过突变在5个氨基酸的间隔里删除3个氨基酸。然后在大肠杆菌中表达以及检测它们刺激骨髓细胞线的增殖能力。与天然的GM-CSF比较，大多数的删除使活性完全丧失，只有很少几个删除保持中等的活性。

三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究★3.其他实验方法鉴定功能残基第二节基于天然蛋白质结构的分子设计对于功能分析，最重要的是数据的解释。在数据分析中，如何区别功能残基替换引起的效应及蛋白质构象变化引起的效应是所有突变分析中共同存在的困难。对于三维结构未知的蛋白质这个问题特别严重，因为不能确定残基的立体位置与周围结构环境，残基对溶剂的暴露程度以及同附近残基的相互作用。虽然有几种方法可以探测突变蛋白质的结构整体性质，但没有一种方法是满意的。在某些情况，溶解度与突变蛋白质的稳定表达可以作为结构整体性的一个标志，因为突变可能破坏蛋白质的球形整体结构，引起蛋白质失活、不溶以及在细胞中降解。利用分析一系列构象灵敏的单克隆抗体的结合能力可以探测突变蛋白的构象变化。

■三、蛋白质设计中的结构-功能关系研究

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域。Winter等将分子剪裁技术成功用于抗体分子的改造。他们将小鼠单克隆抗体分子重链的互补决定子用基因操作方法插到人的抗体分子的相应部位上，使得小鼠单抗分子所具有的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。这项实验有重要的医学价值。一个小的天然蛋白质重新设计成功的例子是Rop，一个反平行四螺旋束。它不是经过简单的点突变，而是通过肽段剪裁。蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。例如Fersht等替换了barnase的所有内核残基，结果表明23％的突变体保留了酶的活性。

■四、天然蛋白质的剪裁

第三节全新蛋白质设计在原子水平认识蛋白质折叠问题对于认识生命过程和设计具有新奇结构与性质的蛋白质有重要意义。这个领域的工作涉及了解决定蛋白质结构及功能的基本物理、化学规律以及蛋白质折叠过程与步骤。全新蛋白质设计正是实现这个目标的重要途径。全新蛋白质设计也称反折叠研究，它是根据所希望的结构及功能设计序列。蛋白质的功能是直接与它的三维结构相关的，通过序列的改变来操纵结构提供功能的多样性。基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，改善它们的药效动力学性质。而全新蛋白设计是另一类蛋白质工程，它合成具有新奇结构与功能的新蛋白质。■一、引言第三节全新蛋白质设计折叠问题与反向折叠问题息息相关，但解决问题的途径是有差别的。蛋白质设计对于蛋白质折叠及反向折叠要回答的关键问题是多少及哪一个序列能折叠为确定的构象具有预想的性能。这是一项在序列空间搜索结构稳定及功能特殊的序列。蛋白质工程工作者所面临的困难问题是如何选择哪一个序列作为合成的目标。选择序列的一个方法是基于生物进化，另一方法是基于全新蛋白质设计，根据稳定不同类型蛋白质的相互作用力来设计不同类型的蛋白质。这些方法已取得明显的进展。例如，离子通道纳米管、血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。蛋白质的全新设计包括从头结构设计和从头功能设计。

■一、引言第三节全新蛋白质设计设计一个新奇的蛋白质结构的中心问题是设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列。要达到这个目标需要克服的基本障碍是线性聚合链的构象熵。例如，如果在具有100个残基的蛋白质中每个残基采取10个可能构象中的一个构象，则这条链折叠成为确定的三维构象所消耗的熵是RTln10100＝568.48kJ/mol。这个数字代表不合适的自由能的真实的量。因此要实现正确的折叠必须借助于许多合适的相互作用，要使一个序列能折叠为确定的三维结构，设计的相互作用能必须超过构象熵。可以采用不同的策略达到这个目标。最主要是使相互作用的强度与数目达到最大。另一个策略是通过共价交叉连接减小折叠的构象熵。根据第一原理设计一个蛋白质，我们必须依赖于分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元。

■二、蛋白质结构的从头设计

一级结构二级结构三级结构四级结构α－螺旋β－折叠第三节全新蛋白质设计分析已知结构的蛋白质，可以认为复杂的三级折叠和四级结构可以分解为有数的二级结构单元，例如螺旋、折叠、转角，它们通过loop连接为三级结构。特殊折叠的稳定性是由一定距离残基间非键相互作用决定的。全新蛋白质设计要求很好地认识蛋白质结构及稳定性的规律。在了解残基形成二级结构单元的倾向性后，要安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核。离子相互作用及氢键可以进一步用于稳定蛋白质的结构。另外一种途径是根据主链的构象限制设计二级结构。

■二、蛋白质结构的从头设计

★1.二级结构模块单元的自组装★2.

配体诱导组装★3.通过共价交叉连接实现肽的自组装■二、蛋白质结构的从头设计第三节全新蛋白质设计★4.在合成模板上肽的组装★5.线性多肽折叠为球状结构★6.基于组合库的全新蛋白质设计二、蛋白质结构的从头设计设计新的蛋白质结构的最简单、最直接的策略是合成单一二级结构单元(α-螺旋或β-折叠股)作为多肽链的片段的模块途径，然后复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。通常，这些二级结构是两亲性的。疏水表面埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中，如图2-7所示。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

模块方法有几个特点，使它成为蛋白质设计有吸引力的第一步。这个方法最大的优点是无论从设计或合成角度来看，它都是简单的。在自组装的模块结构中，关键的设计步骤是二级结构单元。模块途径另一优点是容易合成。α-螺旋或β-折叠股可以通过固相合成仪直接大量合成。二、蛋白质结构的从头设计模块方法的简单也限制了它作为蛋白质设计一般方法的能力。二级结构模块自组装蛋白与单链天然类蛋白比较有如下几个缺点：最突出的缺点涉及蛋白质的稳定性。正像前面所描述的情况，蛋白质设计最主要障碍是非折叠态随机波动的构象熵。在结构设计的情况下，几个非连接链的自组装形成一个独特的结构，它的熵消耗大于单肽链折叠的熵的消耗。通过分子间相互作用结合形成的任何结构的稳定性都必须依赖于浓度，这明显区别于单链蛋白质（天然的或设计的）。它们的折叠靠分子内的相互作用，其稳定性不依赖于浓度。模块方法的另一缺点就是结构的简单重复。它比大多数天然蛋白质有更大的重复性及对称性。尽管有上述缺点，但模块设计模拟了天然蛋白质共同的结构与热力学特征，因此它代表了蛋白质从头设计的一个重要手段。

★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计α螺旋是一个吸引人的建筑模块。因为α螺旋通过氢键达到结构稳定，单一α螺旋在溶液中是稳定的。系统的研究已经取得稳定螺旋构筑的规律。螺旋设计使用的策略包括：①使用形成螺旋倾向性较大的残基，如亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸等；②使用合适的基团去除端基的电荷，防止与螺旋偶极不合适的电荷相互作用；③使用极化或荷电氨基酸引入稳定的氢键或在螺旋中相隔一圈残基间的离子相互作用；★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计④使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的（脂肪的或芳香的）范德华相互作用；⑤使用芳香荷电或芳香硫的相互作用。最简单的在自然界观察得到的α螺旋结构是coiled-coil以及四螺旋束。这些结构在全新蛋白质领域也是首次通过模板方法设计成功。表2-2列出了可溶于水、已经用X射线或NMR测定的超二级结构。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计四螺旋束在全新蛋白质设计中占有独特的位置。螺旋束的热力学及结构规律相当普通，它们已被应用到2螺旋束、3螺旋束、4螺旋束以及n螺旋束的设计中。在结构形成过程中，不合适的构象熵由来自非共价相互作用补偿。这些非共价相互作用包括氢键、电荷电荷、疏水相互作用。螺旋束是基于两亲螺旋，它们的聚集主要是基于疏水相互作用提供足够的结合能量去驱动折叠平衡。埋藏疏水残基获得的结合能约为21MJ/nm2。在热力学研究中的一个规则是：对于多肽链的折叠，折叠态的自由能小于非折叠态几十kJ/mol，不合适折叠熵的作用会逐步由结合足够数目的疏水残基所克服。如16残基中包括4个疏水残基就可以驱动一个疏水过程。相反，电荷-电荷相互作用不能单独提供结合能引起序列折叠。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计coiled-coil是一相对简单的模型体系，已经有不少研究组在结构与设计方面做了出色的工作。coiled-coil结构是2个到4个α螺旋彼此以平行或反平行堆积在一起，螺旋的交叉角接近20°。Crick、Pauling以及Corey于1953年指出，如果两条螺旋彼此成20°的角度倾斜相交，彼此间盘绕，最后结构的每一圈就包括3.5个残基。这与正常的α螺旋每圈3.6个残基稍有差别。这种差别对于蛋白质设计是有意义的。当周期是3.5个残基时，整个结构是每7个残基重复一次。因此，coiled-coil让结构设计可以简化为设计一个7个残基链的重复。Hodges及其合作者设计了一批由简单7肽重复组成的coiled-coil结构并研究了它们的重复特征。

★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

图中序列设计要求同时稳定α螺旋二级结构以及双条螺旋间的相互作用。亮氨酸在2位和5位提供一个疏水界面，赖氨酸及谷氨酸在l位和6位主要提供螺旋间的离子相互作用。图2-8所示的7残基序列的几个重复片段的结构由圆二色散射测定表明形成了coiled-coil结构，而且设计并合成得到的结构比序列类似的天然原肌凝蛋白中相应的结构更稳定。二、蛋白质结构的从头设计简单的7肽重复的设计的成功在于产生了所希望的结构。Hodges等鉴定了它们对于增加或减小稳定性的特征。首先探讨链长度的影响。合成不同长度的重复7肽，比较结果表明，在这个体系中，至少要求含有29个残基才能自组装为coiled-coil。第二步，探讨在二聚界面改变疏水接触的影响。他们合成了由5个7肽组成的肽，在中心7肽2位、5位置的Leu被Ile、Val、A1a、Phe或Tyr所取代。除Phe和Tyr外，coiled-coil的稳定性还与残基的疏水性有关(疏水性Leu>Ile>Val>Ala)。Phe和Tyr虽然有非常强的疏水性，可能是因为结构的立体障碍问题，所以它们的替换不增加稳定性。最后，进一步探讨在两个α螺旋之间增加一个二硫桥是否能增加稳定性。他们通过蛋白质工程在几个天然蛋白质中引人二硫桥。实验证明这种策略有助于加强蛋白质的稳定性。他们合成了一个半胱氨酸在第2个位置的序列，他们发现引入链间的二硫桥能稳定coiled-coil。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计然而他们也发现一些意外的结果。通过二硫桥增加稳定性的程度依赖于设计序列本身的稳定性。没有二硫桥的coiled-coil的稳定性愈大，则二硫桥对蛋白质的稳定性的贡献愈大。例如，一个含有亮氨酸在所有界面位置的coiled-coil，二硫键能增加稳定性13.81kJ/mo1。然而当在接触位置有两个亮氨酸被苯丙氨酸所取代时，肽的稳定性降低，此时形成二硫键仅增加5.02kJ/mol的稳定性。看来，二硫键的形成增加了coiled-coil的刚性，因此妨碍了苯丙氨酸取代亮氨酸后的稳定性。这些实验建议尽管二硫键的设计能增加新蛋白质的稳定性，但是二硫键的立体及几何环境必须小心考虑。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计以上介绍的是设计形成均一的二聚体。O’shea等从头设计了异二聚体coiled-coil。他们设计了两个肽，称为ACIP-p-l及BASE-p-l。在异二聚体中，分子间的盐桥可以稳定复合物结构。而在均二聚体中这些有利的相互作用被相同电荷的排斥所取代。纯化后的肽的表征表明，形成异二聚体的倾向大于均二聚体至少100000倍。pH值及离子强度研究也表明形成异二聚体的倾向性大得多，这也是因为均二聚体的静电的不稳定性。这些结果表明，成功的蛋白质设计不仅依赖于所希望结构的“正设计”，也依赖于替代竞争结构的“负设计”。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计是什么决定coiled-coil的寡聚状态呢？①疏水性残基在coiled-coil结构螺旋间的接触中起调节作用。②还必须考虑侧链间的特殊的相互作用。③通过对GCN4亮氨酸拉链(GCN4leucinezipper)突变体的仔细研究，残基的接触决定coiled-coil肽的寡聚态。

★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计上述结果显示一个围绕设计策略的重要特征是依赖于二级结构模块单元的自组装。因为独立单元不直接连接到多肽链，寡聚的组装状态是由侧链相互作用所决定的，因此，通过模块肽组装设计全新蛋白质必须仔细设计适合于所希望的寡聚状态以及不合适的竞争替代。除coiled-coil外，在天然蛋白质中发现的最简单α螺旋模体是四螺旋束。四螺旋束同coiled-coil一样有助于模块设计策略，即利用二级结构单元自组装为完整的结构。DeGrado及其合作者很成功地利用这个策略设计出非常稳定的四螺旋束，如图2-9所示。

★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计DeGrado等很好地发展了模块方法。首先从二级结构单元出发，他们优化其结构特征，使α螺旋序列在短肽范围内变化，这有利于合成。连接两个α螺旋的转折在α2中有所变化。这些特征都经过优化后合成得到了α4。这些努力使DeGrado等设计并合成了第一个全新蛋白，在溶液中能折叠为稳定的球形构象。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计螺旋束与coiled-coil肽的序列有许多共同之处，它们都是两亲性螺旋。两者主要的差别在于coiled-coil含有一个狭窄的疏水面，而螺旋束含有较宽的疏水面。大的疏水面有利于形成高的寡聚态，四螺旋束比较常见。虽然大多数模块设计集中于α螺旋结构，但仍有一些研究关注β折叠片蛋白。它们是通过合成的β折叠股的结合形成的。因为β结构在溶液中不稳定，所以β折叠与α螺旋相比是较少利用的模块。它们必须通过氢键连接在一起。与α螺旋一样，形成自组装多聚体的β折叠股的序列必须是两亲性。

★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计对于模块设计，什么特征是最基本的？是否存在设计形成二级结构及自组装肽的一般规律？因为自组装主要涉及疏水相互作用，所以设计的序列必须是两亲性的。这个两亲性的二级结构序列有一个极性和非极性残基的周期性。形成两亲α螺旋，通常要求序列非极性残基每隔3个或4个位置出现一次。有关实验证明极性和非极性残基的周期性出现对于二级结构的形成及自组装起着决定性作用。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计是否必须考虑氨基酸残基形成二级结构的倾向？是否α螺旋必须由α螺旋的形成者组成？β结构必须由β结构形成者组成？实验结果证明固有的倾向性对结构的支配能力可以被序列的极性/非极性周期性所征服。例如，如果一个序列是由很好的α螺旋形成者组成，但它的极性/非极性残基的周期是2，它形成自组装的β折叠股。相反，一个序列由很好的形成者组成，但是极性/非极性周期是3或4，则它形成α螺旋。因此，当序列的周期性是严格控制的，则自组装模块的结构能容忍序列在一定范围内变化。★1.二级结构模块单元的自组装（模块方法）

二、蛋白质结构的从头设计全新蛋白质设计的第二个策略是使用一个配体(典型的是一个金属离子)诱导模块蛋白片段的组装，如图2-10所示。★2.配体诱导组装

一个配位结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并驱动肽自组装。Lieberman和Sasaki利用Fe(II)诱导组装形成一个三螺旋束。

二、蛋白质结构的从头设计★2.配体诱导组装

他们合成了一个15肽的两亲α螺旋，双吡啶的一部分结合到N端。根据已知的Fe(II)与3个双吡啶配合物的结构特征，他们在3个α螺旋端点的双吡啶间设计了一个金属结合位点，使金属络合诱导三螺旋束的形成，如图2-11所示。圆振二向色散谱表明，孤立的多肽没有规则的二级结构，但Fe(II)诱导了二级结构占优势的结构的形成。二、蛋白质结构的从头设计★2.配体诱导组装

Ghadiri

等也进行了类似的工作。他们在15肽双亲α螺旋的N端接一个双吡啶基团，使用二价金属离子如Ni(II)、Co(II)或Ru(II)诱导形成三螺旋束。Ghadiri研究组扩展了金属离子辅助自组装策略，从三螺旋扩展到四螺旋束。他们合成了15残基的两亲肽，并把吡啶基接在N端，Ru(II)的亲和作用使含氮的芳香杂环提供一个很强的驱动力组装四螺旋束，如图2-12所示。

二、蛋白质结构的从头设计★3.通过共价交叉连接实现肽的自组装

设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当几个没有连接的肽链进行自组装时，熵势垒是比较难以克服的。通过共价交叉连接可以减少构象熵。因此通过共价连接它们的预组织肽是直接形成所希望结构的有力途径，如图2-13所示。二、蛋白质结构的从头设计★3.通过共价交叉连接实现肽的自组装

在自然界惟一用于交叉连接的方法是二硫键。在全新蛋白设计中也使用其他种类的交叉连接。例如，Richardson、Erickson等在Betabillin的设计中使用称为DAB的新的交叉连接方法。在8股-barrel中形成简单的从上到下连接方法，如图2-14所示。

合成自组装肽也可以不使用二硫键或其他人工连接片段。赖氨酸的侧链基团以及谷氨酸、天冬氨酸的侧链羧酸彼此间能形成肽键，它们也能与主链的N端或C端形成肽键。这样交叉连接导致枝杈结构，一个优点是链交叉连接限制了链彼此间的位置，因此减少了形成独特结构的熵消耗。二、蛋白质结构的从头设计★3.通过共价交叉连接实现肽的自组装

这种策略对于设计由平行或反平行二级结构单元组成的结构是很适用的。上述例子与天然蛋白有显著差别，但具有胰凝乳蛋白酶的活性。Stewart及其合作者设计的Chymohelizyme是这种策略的一个例子。在这个平行的四螺旋束中，4条合成的多肽链通过肽键连接。如图2-15所示。二、蛋白质结构的从头设计★4.在合成模板上肽的组装

Mutter及其合作者发展了一种模板组装合成蛋白(TASPs)方法。他们不是使用天然蛋白中的turn和loops连接二级结构单元，而是使用图2-16中所显示的人工模板。与天然线性蛋白质不同，α螺旋和β折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。TASP分子的螺旋和股通过模板结构导向形成所希望的构象。

二、蛋白质结构的从头设计★4.在合成模板上肽的组装

Mutter研究组使用的模板是寡肽，一个典型的例子是环十聚体。其模板是：乙酰基-Cys-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys-酰胺。这个模板用于形成两个反平行β折叠股，通过一个在一端的Pro-Gly转折和一个在另一端的二硫键形成两个反平行的β折叠股。因为它有一个环结构，因此这个的构象因受到限制而比较确定，并且残基侧链的取向也比较确定。这个特点非常重要，因为4个赖氨酸侧链的ε-氨基是作为几个二级结构单元的连接位点。例如，设计平行的四螺旋束的单一肽链的序列Glu-Ala-Leu-Gln-Lys-Ala-Leu-Lys-Gln-Ala-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly是两亲性的α螺旋。每条肽链是连接到环肽上4个赖氨酸侧链的ε-氨基上。TASPs的特点是每条肽链显示最低限度的浓度依赖关系，但是一旦它们连接到模板上，它们的结构倾向于稳定并且不依赖于浓度。

二、蛋白质结构的从头设计★4.在合成模板上肽的组装

TASP方法一个可能的限制是把不同类型的肽连接到一个给定的模板上也许是困难的。任何一个肽链连接到模板的赖氨酸都有可能导致模板上4个赖氨酸的偶联。Mutter等在模板的赖氨酸上加上不同的保护基。TASP方法加以改进能够构筑不同形貌的结构包括βαβ、4α/4β结构。TASP能够模拟单链肽不能模拟的天然蛋白的性质。例如，短的、孤立的肽一般不能作为抗原，因为它们的结构在溶液中不稳定，而且在体内迅速降解。因此在它们作为抗原使用之前，通常把这些肽接到大的蛋白载体上。Mutter等模拟大的天然蛋白抗原的性质，把来自HLA-A2蛋白的α螺旋序列的4个复制序列连接到环肽模板上。他们得到的分子虽然不含载体蛋白但仍能提高识别能力。因此TASP策略能模拟天然蛋白的关键性质。二、蛋白质结构的从头设计★4.在合成模板上肽的组装

Sasaki等使用一个卟啉作为模板，连接α两亲螺旋的4条复制序列，如图2-17所示。得到的最终蛋白质称为Helichrome，相当稳定。但是不存在卟啉基团时，这个孤立肽不能形成稳定的结构。设计的Helichrome不仅形成稳定的球形结构，而且具有酶活性。二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠形成球形的确定的三维结构是全新蛋白质设计追求的目标之一。把一个线性肽折叠形成独特的三维结构的主要障碍是构象熵，这需要精心设计一系列的相互作用才能稳定结构。这方面工作已取得重大进展。单链多肽成功地折叠为稳定的球形结构的第一个例子是DeGrado及其合作者完成的α4结构。首先合成含16个残基的α1

，然后αl自组装为四螺旋束。在α4中，这些螺旋是由Pro-Arg-Arg转折连接的，74个氨基酸的序列由一个合成的基因所表达。折叠后的最后分子相对非折叠形式自由能的差为94.05kJ/mol，比天然蛋白质更稳定，其差值约20.9~41.8kJ/mo1。

二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

从α4结构的极端稳定性看出，α4是一个理想化的结构。研究人员把全新设计的复杂性简化为几个涉及天然蛋白稳定性的关键特征，然后优化这些特征，称最小化途径。稳定α4的最重要特征是α螺旋明显的两亲性。螺旋对溶剂的暴露面以及埋藏的内部面可以由表面位置的荷电残基(Gln或Lys)和埋藏的极端疏水侧链(Leu)所确定。疏水表面的埋藏一般认为是蛋白质折叠的主要驱动力。α4显著稳定性的主要特征是形成明显的疏水核。α4的设计还考虑其他对稳定性有贡献的因素，如形成Glu-…Lys+盐桥，螺旋偶极的电荷中和，增加在螺旋/转折连接处的柔性。

二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

尽管最小化途径已经取得许多成功，但它也有某些缺点。由于使复杂性最小化，因此设计的结构比天然蛋白简单且有更多的重复部分。这些重复的序列使结构更易变，难于精确测定。α4缺少天然蛋白那样好的互补堆积。Raleigh和DeGrado相继修饰四螺旋束序列，使其较少重复以及更易形成有序结构。他们使用几个非极性侧链残基，例如Val、Phe、Trp以及Ile等替代埋藏的赖氨酸残基。它们比赖氨酸有更多的构象限制以及能够增加螺旋间堆积的立体互补性。因此DeGrado及其合作者构筑了结构及热力学性质比原来的分子更接近天然蛋白的分子。一个减少链内侧柔性的策略是在新蛋白中引入一个金属结合位点。二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

Hecht等利用一个替代最小化途径的方法设计了没有重复序列的四螺旋束Felix。他们的目标是设计与合成一个由不同侧链间特殊相互作用所稳定的独特的三维结构的类天然蛋白。Felix避免了简单的重复序列，它的序列与天然蛋白类似：四螺旋中每一条都是不同的；每条螺旋本身没有重复的片段；在79个氨基酸序列中包括19种天然氨基酸。在Felix中4条α螺旋均为两亲性，尽管程度比α4低但与天然蛋白质相近。在四螺旋束中每个重要位置的残基都选择在天然蛋白的相应位置上频繁出现的残基。

二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

螺旋确定后要考虑链间的堆积，适当修饰序列使其很好的互补。对于一个成功的设计，内堆积是一个重要因素，也是最难实现的因素。最后引入一个分子内的二硫键连接第一个螺旋上的Cys11与第四个螺旋上的Cys71。二硫键的作用是：减少构象熵并稳定构象；它可以探测第一条及第四条链彼此间的取向。图2-18列出了Felix的序列及建议的飘带图。

二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

蛋白质设计涉及要稳定一个所希望的结构及不稳定一个竞争结构。设计一个互补的替代结构称为“负设计。Felix的设计结合了“负设计”的某些特征。例如，在设计α螺旋中避免含有有利于形成β折叠片的某些疏水和亲水残基，他们选择转折的长度以防止形成螺旋发夹。他们构建了一个合成基因，在大肠杆菌中高水平地表达蛋白。他们得到如下结果：①谱学研究证明Felix折叠成紧密的球形结构；②CD谱证明α螺旋在蛋白质中占优势；③Cys11-Cys71二硫键的形成说明虽然Cys11、Cys71在序列上是远离的，但在三维空间它们是彼此靠近的，第一条α螺旋堆积靠近第四条螺旋；④二硫键是在分子内而不是分子间；⑤荧光谱表明在位置15的色氨酸埋藏在小极性环境中；⑥荧光猝灭研究证明色氨酸非常接近Cys11-Cys71二硫键。这些结果说明Felix的折叠结构是非常类似于图2-18模型。

二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

虽然Felix折叠为近似正确的结构，但它不是非常稳定的。去折叠实验表明折叠构象只比非折叠态稳定(<4.18kJ/mol)。在Felix设计中不成功的地方正是蛋白质本身的核心问题。在蛋白质内疏水侧链间的特殊相互作用是形成独特结构的关键，但这种设计很困难。实质上，Felix的低稳定性可能表明它没有一个独特的很好堆积的疏水内核。虽然四螺旋束代表一个诱人的模型体系，但对于设计全新蛋白不能限制于这些结构。在天然蛋白中另一个共同观察的结构是8股α/βbarrel(丙糖磷酸异构酶)。Goraj等设计了一个类似于α4，称为Octarellin的新奇的α/β

barrel的氨基酸序列，它是由单一结构单元多次重复形成的理想化的结构。1994年Qunn等设计了一个称为Betadoublet的β折叠蛋白质。早期Richardson实验室有关Betabellin的工作表明β折叠蛋白质可能比α螺旋蛋白质更难设计。主要原因是β-体系在水溶液中溶解度很低。二、蛋白质结构的从头设计★5.线性多肽折叠为球状结构

以上设计的蛋白质都是基于在天然蛋白质中频繁观察到的结构模体设计的。Ptitsyn及其合作者设计了一个三维结构与天然蛋白质不同的结构。图2-19所示的结构是“OpenSandwich”，由4串β折叠片对着两个α螺旋。这个蛋白质称为Aibebetin。Ptitsyn等把缬氨酸残基放在β串i、i+2以及i+4位置，把亮氨酸放在α螺旋的i、i+3、i+4以及i+7位置。这个序列有利于形成二级结构的两亲性单元。

二、蛋白质结构的从头设计★6.基于组合库的全新蛋白质设计

蛋白质组学是目前备受关注的新领域，它包括天然蛋白质的多样性、相互作用、结构以及功能。它回答的问题是“什么是天然存在的”。组合库方法要回答的问题是“什么是可能的”。要回答这个问题要构筑大的全新蛋白质库。比较库中的全新蛋白质与自然进化选择的蛋白质，可以得到很多有用的信息。所有可能的氨基酸序列是一个天文数字，但是实际能形成独特三维结构的序列仅占序列空间的很小部分。组合库的构筑既要顾及序列的多样性又要利用合理设计大大减少序列的数目。

组合库设计的一个核心问题是埋藏疏水部分。一个常用的方法是基于极性(P)和非极性(N)氨基酸的“二元模式”。二元模式一方面要有利于形成二级结构，另一方面又要埋藏疏水残基。二元模式可用于二级结构两亲片段，一面完全是极性残基，另一面完全是非极性残基。二、蛋白质结构的从头设计★6.基于组合库的全新蛋白质设计

α螺旋的周期是每一圈含3.6个残基，β折叠股有一个交替的周期(上-下-上-下等)。α螺旋一面极性、一面非极性顺序可为P-N-P-P-N-N-P-P-N。β折叠股一面完全疏水、一面完全亲水，一个交替序列可为P-N-P-N，如图2-20所示。全新蛋白的组合库的第一个报道是形成四螺旋束的氨基酸序列二元设计，如图2-20(a)、(b)。组合库是通过合成基因在细菌中表达制备，同时通过基因编码实现组合多样性。二、蛋白质结构的从头设计★6.基于组合库的全新蛋白质设计

从实验结果看出二元模式方法可以得到一大批可以折叠为α螺旋的可溶蛋白质，但预定的目标并没有完全达到。其原因是这个方法没有很好地考虑内核的堆积。为了克服上述不足，又发展了第二代二元编码组合库。如图2-21，新库以原来的74残基组合库中的第86号蛋白为起始材料，对其转折区域作些小修改。

最重要的修饰是4条螺旋中的每条螺旋加6个组合的不同残基，组合的方式仍服从二元模式。从第二代组合库中任意取出5个蛋白质作进一步的分析证明这些蛋白质是单体且螺旋度很高。化学失活实验表明这些蛋白的稳定化自由能比其母体高2-3倍。NMR谱研究证明这些蛋白质是很好折叠的天然类蛋白质。第二代库的成功表明，二元编码方法能够产生类似于天然蛋白质的全新蛋白质。

二、蛋白质结构的从头设计★6.基于组合库的全新蛋白质设计

二元编码方法不仅用于α螺旋，也可用于β折叠片。两亲性的β折叠股有一个P-N-P-N-P-N周期性。建立一个基于这个周期性的编码β折叠片蛋白质的组合库，极性残基在一面而非极性残基在另一面[如图2-20(c)所示]。组合库中的蛋白质含有6条β折叠股，每一条有二元周期P-N-P-N-P-N-P。CD谱研究表明这些蛋白质具有β折叠片结构。β折叠片自组装为电子显微镜及原子力显微镜可观察的纤维状蛋白质，类似于在几种神经退化疾病中发现的淀粉状纤维。这种纤维状蛋白质类似于天然淀粉，新的纤维由折叠片二级结构组成并能与刚果红诊断染料结合。组合库的设计中要考虑优化疏水核，通过筛选发现最优的堆积相互作用。主要使用两种筛选方法：第一种是使用一维1H-NMR谱；第二种方法是使用电喷雾质谱(ESI-MS)观察H-D交换动力学。除了考虑疏水核堆积外，还要考虑优化二级结构单元间的界面。

二、蛋白质结构的从头设计★6.基于组合库的全新蛋白质设计

近年来发展了一些计算机辅助设计方法，在开始实验之前先进行计算机筛选。一般分为两步，第一步建立侧链的旋转构象库(rotamer)；第二步把Rotamer库作为输入，计算低能序列组合的可能性。Dahiyat以及Mayo首先报道了自动计算机筛选序列的工作。他们采用Zif268的锌指结构域并使用死端消除法，搜索残基的低能安排。对于28个残基序列，可能的组合多样性是2028=3×1036。每个残基需要考虑几个旋转构象，可能的组合数目应为1.1×1062。利用死端消除法可以减少计算工作量，他们从库中筛选出FSD-1。合成这个序列并进行NMR研究，结果表明FSD-1非常类似于天然的靶结构，其与天然靶结构的均方根偏差仅为0.198nm。利用组合库方法寻找全新蛋白质已在如下方面取得成功：α螺旋；β折叠片；单体；自组装为有序的排列；堆积为天然类蛋白质；超热稳定性；结合辅因子的能力；催化活性。

★1.通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能★2.键合及催化的从头设计★3.在全新蛋白质中引入结合位点■三、蛋白质的功能设计第三节全新蛋白质设计★4.催化活性蛋白质的设计★5.膜蛋白及离子通道的设计★6.新材料的设计三、蛋白质的功能设计★1.通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有一定的功能。功能设计主要涉及键合及催化。为达到这些目的可以采用两条不同的途径：①反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；②从头设计功能蛋白质。执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合获得新的活性。修饰进化亿万年的蛋白质，执行我们自己选择的功能是非常诱人的任务。自然界已经向我们提供许多相当稳定、能够耐受序列修饰改变的结构骨架。通过修饰天然结构得到专一性及活性改变的天然蛋白质是可能的，在如下范围已取得成功：DNA结合专一肽；改变辅因子的专一性；改变底物的专一性。三、蛋白质的功能设计★1.通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能反向拟合能把新奇的性质附加到原蛋白质骨架的结构上。几个通过蛋白质工程使天然蛋白质获得新功能的实例：(l)引入金属结合位点。在大肠杆菌中引入新的过渡金属结合位点以及在溶菌酶中引入新的钙结合位点，使金属溶菌酶的活性及热稳定性都优于天然酶。(2)位点专一DNA裂解。重组脱氧核糖核酸酶的一个52残基的DNA-结合碎片共价连接一个鳌合试剂EDTA后形成一个序列专一的DNA裂解蛋白质。催化抗体的设计是反向拟合天然蛋白质最广泛、最有力的应用。抗体是嫁接功能的理想蛋白。通过改变loop区免疫体系能产生新奇的结合专一性。免疫学家以及化学家诱导哺乳动物免疫体系产生不仅能结合专一抗原而且能催化不同化学反应的抗体。催化抗体的核心是使用类似于反应过渡态的抗原。三、蛋白质的功能设计★2.键合及催化的从头设计能结合特殊配件的新蛋白质设计的早期工作是Gutte及其合作者开展的。1979年他们报道了能与核酸相互作用的34个残基肽的设计、合成与表征。如图2-22所示的序列形成ββα结构，它能结合三核苷酸2’-甲基-鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤。Thr12、Gln14以及Gln16侧键与碱基部分形成氢键；Phe1、Phe3以及Tyr5与碱基堆积或插入；Lys28和His32与三核苷酸配体磷酸盐形成稳定盐桥。一个连接Cys10与Cys33的二硫键加强了结构的稳定性。三、蛋白质的功能设计★3.在全新蛋白质中引入结合位点

全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外，还要设计新的结合位点及催化性质。在设计和合成α4后，DeGrado及Regan两个研究组修饰这个非常稳定的序列使其具有结合金属的位点。他们选择设计了一个能结合Zn2+的四面体位点。Regan等设计了一个像几种天然蛋白质那样的结合位点。他们通过计算机设计，以α4结构模型作为初始结构，每个残基都分别被Cys及His所取代。通过计算机模拟找到形成Zn2+的四面体配位位点。他们找到了第二条螺旋的Cys21、His25及第三条螺旋的Cys47和His51形成合适的位点。通过在大肠杆菌中基因表达α4蛋白质的变种。纯化后的蛋白质的表征结果表明：Zn2+的解离常数是2510-8mol/L；结合位点在单一蛋白质的单体内；结合金属后蛋白质的二级结构没有改变；结合Zn2+后增加了蛋白质的稳定性；半胱氨酸巯基对结合是最重要的。DeGrado等通过修饰α4序列设计了Zn2+的结合位点。实验结果表明，结合金属后蛋白质变为更有序的结构。三、蛋白质的功能设计★3.在全新蛋白质中引入结合位点

新的金属蛋白质的构筑不限于α螺旋。Pessi等根据免疫球蛋白McPC603设计了一个在β折叠片骨架引入结合位点的蛋白质，称为“minibody”。这个蛋白质含61个残基，图2-23表示它的建议的结构模型及序列。

三、蛋白质的功能设计★3.在全新蛋白质中引入结合位点

全新蛋白结合位点的设计不仅限于金属位点。DeGrado等在α-2序列中引入血红素结合位点。Robertson等构筑了由两个62肽组成的新奇四螺旋束。这个自组装的大分子结合了4个平行的血红素并具有与天然蛋白质相似的光谱及电化学性质。特别诱人的是观察到红血素-血红素电化学协同作用。这些工作表明，全新蛋白质不仅能结合辅因子而且能模拟天然蛋白质的某些复杂性质。

★4.催化活性蛋白质的设计

这类设计的早期代表性工作是Hahn设计的Chymohelizyme及Sasaki等设计的Helichrome。这两个设计蛋白质均使用人工交叉连接预组织结构并使活性口袋的位置接近催化活性部分。它们的催化位点与天然酶相似。

三、蛋白质的功能设计★4.催化活性蛋白质的设计

Benner设计了一个人工脱羧酶(ART-OAD)。他们放置一个赖氨酸在两亲螺旋极性面上并非常接近其他赖氨酸链，其结构如图2-24所示。其意图是使中心的赖氨酸作为亲核试剂，同时支架上的赖氨酸应当是荷正电，能与荷负电的底物成键。通过固相方法合成ART-OAD，CD谱以及NMR谱研究表明α螺旋占优势。它的二级结构依赖于浓度，表明两亲螺旋的组装体为期望的多聚体(可能是四聚体)。合成肽的Kcat(0.4min-1)比天然酶慢5个数量级但仍比脱羧反应快900倍。

三、蛋白质的功能设计★5.膜蛋白及离子通道的设计

膜蛋白在许多生物过程中起重要作用。设计与构筑具有预期结构与性能的膜蛋白有非常重要的意义。膜蛋白结构形成的驱动力与在水中可溶的蛋白不同，设计及合成中所遇到的困难也不同。例如疏水效应要求在溶液环境中非极性残基在内部，极性残基在外部，但对于在非极性环境中的膜蛋白就完全不同。膜蛋白在体内表达或在体外合成形成典型的包含物。一个全新膜蛋白从一个不溶水的聚集体转换为类似于膜的环境要求构象变化。尽管存在很大困难，但科学家们仍设计表征了一些全新膜蛋白。三、蛋白质的功能设计★5.膜蛋白及离子通道的设计

(1)Montal等使用Mutter的模板辅助方法设计了一系列模拟天然离子通道特征的全新微孔蛋白质Synporin。4条相同的23肽α螺旋被固定在载体模板上，并且相互平行，如图2-25所示。CD谱研究支持了图2-25所示的模型。结果表明，101个残基的Synporin主要是α螺旋。根据设计，非极性残基侧链形成外亲脂表面，能与脂双层相互作用，同时螺旋的极性侧链形成中心孔。表征实验证明新蛋白质形成了离子通道。这些通道具有如下特点：单通道；能区别不同的阳离子；在毫秒时间范围内打开与关闭；对局部麻醉通道阻塞剂敏感。

三、蛋白质的功能设计★5.膜蛋白及离子通道的设计

(2)根据天然离子通道的螺旋束结构，Lear等设计并合成了含有简单两亲α螺旋的离子通道。这些离子通道的特点是：序列与天然离子通道序列不同；它不用模板，是通过自组装形成围绕一个中心亲水孔的多聚体。它虽然简单，但仍具备天然离子通道的基本特征。

★6.新材料的设计

在生物体系中蛋白质的作用涉及结构与功能。通常情况下，结构性质支配功能。例如，纤维蛋白、α-角蛋白、β-角蛋白、胶原蛋白及弹性蛋白的不同结构性质决定头发、蚕丝、皮肤及弹性纫带的性质。类似的、新奇的多肽材料的结构可以充分提供新的功能。三、蛋白质的功能设计★6.新材料的设计

自组装是构筑新材料的重要方法，是材料科学和蛋白质折叠的共同的课题。Ghadiri等设计并利用了多肽模块自组装成中空纳米管的新材料。它采取一个平面环形构象，如图2-26所示。在酸碱性为中性情况下，谷氨酸侧链荷负电，同时环肽彼此排斥。然而，在酸性情况下，酸性基团质子化并形成平面分子间的氢键，替代了环肽间的排斥。因此介质的酸化导致环肽的自组装。

■计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类（内核、表面、边界）、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测、负设计等方面内容。

第四节计算蛋白质设计

★一、能量表达★二、能量优化★三、序列优化★四、序列-结构专一性★五、底物专一性设计★六、金属结合位点的设计第四节计算蛋白质设计

★一、能量表达

蛋白质设计通过能量表达（函数）或力场计算给定序列的能量，决定系列序列的能量顺序，并了解蛋白质内的相互作用力。能量的表达包括内坐标项、范德华作用项、氢键项、静电相互作用项、溶剂效应项及熵效应项等。项目的选择是根据提高实验与理论的相关性的要求进行的。改善的能量表达用于设计新的序列，完善这个循环。

在典型的分子力学力场中，共价键、键角、扭角等是必须考虑的。在产生旋转构象集合（库）和修饰蛋白质主链时这些内坐标项都应该包括。通过蛋白质结构数据库的统计分析能产生很好的内坐标项。※①内坐标项第四节计算蛋白质设计

★一、能量表达

范德华势涉及蛋白质内的堆积，堆积专一性对蛋白质设计非常重要。对于蛋白质内核的设计，堆积是非常关键的。范德华势提供了侧链专一性堆积的物理基础，据此可以设计很好折叠的蛋白质。

氢键对蛋白质设计也非常重要，特别是对α螺旋及全序列设计。在某些蛋白质