DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介

分子生物学讨论PART11.DNA提取的原理和方法2.限制性核酸内切酶切割的原理和方法3.DNA琼脂糖凝胶电泳结果和分析及其应人类基因组DNA提取主要内容1、基因组DNA2、质粒DNA3、细胞器DNA

CTAB法

SDS法其它方法碱裂解法煮沸法差速离心法基因组DNA

CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB法流程图SDS法SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法DNA提取缓冲液

SDS法流程图（以动物组织为例）其它方法浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒DNA碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。细胞器DNA差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。DNA提取的基本步骤材料准备细胞裂解核酸分离、纯化核酸沉淀、溶解End限制性核酸内切酶一、限制性内切酶的发现1．限制性核酸内切酶：

---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。2、发现早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰(Modification)系统（R-M系统）。二、概念核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3’端或5’端）逐个水解下核苷酸核酸内切酶：从核酸分子内部切断3’,5’-磷酸二酯键限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶三、限制性核酸内切酶的分类1、第一型（TypeI）：既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；2、第二型（TypeII）：只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位

点可知、固定是，是最常用的限制性核酸内切酶；3、第三型（TypeIII）：同时具有修饰及认知切割的作用徐师大-屈艾老师制作28四．核酸内切限制酶的类型特性（7项）I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单链多肽2种不同的亚基徐师大-屈艾老师制作29五、Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性1.为单链多肽,最适pH6-8,能被盐抑制、被Mg2+激活；2.底物DNA分子双链中有特异性识别序列

通常有4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识

别序列）3.一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子（有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平齐末端之分。

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表：几种常见的限制性核酸内切酶徐师大-屈艾老师制作31六、识别序列识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文序列。识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。徐师大-屈艾老师制作32

七、

切割类型检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（3’-和5’-

）；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA片段。八、末端粘性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的就是黏性末端意义：

1、便于连接：只要粘性末端互补就可以连接；2、5’端标记：凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶进32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶

添加几个多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）

造成人工粘性末端；

3、补平成平齐末端：在DNA聚合酶的作用下补齐末端平末端：而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端徐师大-屈艾老师制作36

九、产生的末端特征

我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。

平末端的DNA片段与粘性末端相比，则不易于重新连结，耗能多。有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等徐师大-屈艾老师制作38十．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1）

DNA的纯度DNA的甲基化程度酶切消化反应的温度DNA的分子结构

核酸内切限制酶的缓冲液

关于限制性内切酶的星活性徐师大-屈艾老师制作391、DNA的纯度核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。若污染了在DNA制剂中的某些物质后例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以及高浓度的盐离子等都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。徐师大-屈艾老师制作40

为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本）②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。③延长酶催化反应的保温时间。

41在有些DNA制剂中（尤其是按微量碱法制备的）会含有少量的Dnase（活性需要有Mg2+的存在）的污染。而在DNA的贮存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA，因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后（内含Mg2+），DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。徐师大-屈艾老师制作42

2、DNA的甲基化程度

限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈地影响酶的活性。

为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备的质粒DNA。

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3、酶切消化反应的温度

不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。徐师大-屈艾老师制作44

4、DNA的分子结构

DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差异造成的。

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5、限制性核酸内切酶的反应缓冲液

核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：

氯化镁或醋酸镁，氯化纳或醋酸钾Tris-HCl（-AC）,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)牛血清白蛋白（BSA）酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子的，通常是Mg2+。购买时厂家会提供专门的缓冲液并有说明其成分。有些核酸内切酶可以在2种甚至4种缓冲液中均有较高的催化活性。

对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能

最佳，一般为pH6—8。徐师大-屈艾老师制作46

6.星活性在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象称为Star活性。

有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例：EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G↓AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5％（体积分数），那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星活性，以EcoRI*表示。徐师大-屈艾老师制作47七、限制酶消化反应的步骤例：0．2—1．0ugDNA进行消化的典型反应步骤如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18ul。加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。加入1—2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。徐师大-屈艾老师制作48将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。加入0．5mol／LEDTA(pH8．0)使终浓度达10mmol／L，以终止反应。如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，即可加样进行电泳。纯化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。徐师大-屈艾老师制作49

六.限制性内切酶反应的终止

消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，大多数限制性内切酶的钝化方法是65℃温浴5分钟。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液(如加入0．5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)？以终止反应。此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。徐师大-屈艾老师制作50八.使用限制酶的注意点（4点）1、限制酶十分昂贵!遵循以下建议可以最大限度地节省开支。为能从贮存管内取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可。这样，你可以取到至少0．1ul的酶量。浓缩的限制酶也可在使用前用1X限制酶缓冲液稀释。但切勿用水稀释以免酶变性。徐师大-屈艾老师制作513、尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的1／10，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。4、

通常延长消化时间可使所需的酶量减少。这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行微胶电泳以判断消化进程。琼脂糖凝胶电泳（DNA）主要内容常见问题与解决办法相关概念实验方法凝胶电泳

当一种分子被放置在电场当中时,它们就以一定速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。在电泳中使用一种无反应活性的稳定的支持介质,可使对流运动降低，故电泳的迁移率与分子摩擦系数成反比。因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异,以及所带的净电荷的多少,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。

生理条件下,核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态,因此,当核酸分子被放置在电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。决定因素

DNA的分子大小线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。决定因素

DNA分子的构象

DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

电源电压在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。

离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA），一般配制成浓缩母液，储于室温。实验步骤实验器械实验方法试剂配制

1.5×TBE缓冲液：450mmol/LTris-硼酸，10mmol/LEDTA，pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。制胶1.根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%）。琼脂糖粉末与0.5×TBEbuffer的比例参考下表，常用琼脂糖浓度为0.7-1%。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围实验方法—制胶1.在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。2.使溶液冷却至50℃-60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5μg/ml）或按照1μL/30mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。3.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。4.在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。实验方法—上样1.取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1μl样品与5μl6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。2.上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40μl为上限，大孔200μl为上限，具体和制胶膜规格相关）。3.每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。实验方法——电泳1.加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110V，电流在40mA以上。2.当条带移动到距凝胶前沿约2cm时（约40min），停止电泳。3.紫外下拍照并观察。注意事项1.5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，取5×TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。2.用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。3.琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。4.凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。结果图常见问题与解决办法凝胶制备1.微波炉溶解琼脂糖时，胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾，

1）总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量

2）2%以上胶液设置中火加热

3）胶液剧烈沸腾时，停止加热，移开三角锥瓶，请戴上防热手套，小心摇动三角锥瓶，然后再次加热，胶液沸腾直至胶清澈，保证琼脂糖完全溶解。2.琼脂糖电泳图像背景模糊不清琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。完全溶解的琼脂糖胶液清澈，三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。3.加热后水分蒸发，如需要应加入热的蒸馏水，补足到原来的重量，摇匀。电泳1.DNA条带模糊，拖尾DNA降解。避免核酸酶污染。DNA上样量过多。减少凝胶中DNA上样量。电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。DNA样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。DNA变性。电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。2.DNA条带淡弱或无DNA带DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。分子大小相近的DNA带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。DNA变性：电泳前请勿高温加热DNA链，用10mmNaClBuffer稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。3.DNAMARKER条带扭曲配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后，再调电压。尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。EndPART21.RNA提取的原理和方法2.RT-PCR的原理和方法3.RNA琼脂糖凝胶电泳结果和分析及其应用RNA提取的原理和方法主要内容RNA分类目的难点1.原理2.方法提取流程两条途经知识拓展RNA提取的原理rRNA（80-85%）

tRNA、核内小分子RNA(10-15%)mRNA（1-5%）真核细胞质总RNA人类细胞质RNA提取原理返回分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物分离提纯RNA的目的返回核糖残基的2'和3'位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量丰富，加热后仍能正确折叠恢复活性，不易失活需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性分离主要难点——RNA的不稳定性返回RNA提取的方法实验室酵母RNA的提取1.RNA的提取2.RNA的离心分离3.RNA的纯化2、方法及原理RNA的提取流程

1、样本前处理

2、细胞裂解——匀浆器

3、RNA的纯化及获得样本的选择样本的保存样品的选择

选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织许多植物组织中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融样品的保存返回匀浆器：用于使样品均匀化的装置，可使组织、细胞或细胞组分等破裂分散成小颗粒，成为比较均匀的悬浮液。常由精细加工的研棒、管子和电动搅拌器构成。返回

1.有效地使核蛋白复合体变性；

2.对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；（最关键）

3.有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；

4.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。RNA的提取的要点89焦碳酸二乙酯（DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氰酸胍（TRIzol法）

：目前被认为最有效的RNA酶抑制剂。裂解组织同时使RNA酶失活常用的RNA酶抑制剂氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物。和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶的活性。

其他：SDS、尿素、硅藻土RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin):大鼠肝或人胎盘中提取得来。酸性糖蛋白。非竞争性抑制剂。可以和多种RNA酶结合，使其失活。返回RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径1)，提取总核酸，然后直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。2)，提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；第二种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。方法一:总RNA的试剂盒快速提取

——TRIzol法

TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍(常用的RNA酶抑制剂）等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。且是一种简便、经济、适合大量样本的RNA提取方法

1.TRIzol法1）细胞裂解：用TRIZOL试剂直接从细胞或组织中提取总RNA2）流程简述：提取液加酚氯仿水样层（含RNA）和有机层（含蛋白和DNA）收集水样层

RNA沉淀

纯化的RNARNA离心异丙醇②乙醇、离心、去上清基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)离心、弃上清①离心、弃上清晾干（不完全）适量DEPC水溶解TRIzol法提取流程操作步骤1.样品处理组织：50-100mg组织中加入1mlTROzlo试剂。单层细胞：加入TROzlo试剂1ml/cm2平板。悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1mlTROzlo试剂。2.将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。3.加入0.2ml（1mlTROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。4.于2-8℃12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。5.取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。6.于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。7.向沉淀中加入1ml75%乙醇，轻轻混匀。8.于2-8℃7500g离心5min后弃上清9.将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。方法二:氯化锂法提取总RNA本方法用高浓度尿素来使蛋白变性和抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA

，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。1：对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中2：匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟3：取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤24：沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟5：取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。6：70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。7：RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。返回

扩展：RT-PCR100RT-PCR原理原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。总RNA的提取cDNA第一链的合成PCRRT-PCR方法1.在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适DEPCH2O使总体

积达11μl。在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、

离心。

2.70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入

下列试剂的混合物：10×PCRbuffer2μl，25mMMgCl22μl，

10mMdNTPmix1μl，0.1MDTT2μl

轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。

3.加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。

4.于70℃加热15min以终止反应。

5.将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的

RNA。