第三章 植物细胞工程的基本原理和技术基础

第三章植物细胞工程的

基本原理和技术基础一、植物组织培养（PlantTissueCulture）：指通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。

植物组织培养是植物细胞工程的基础第一节、植物细胞工程基本原理狭义：愈伤组织培养广义：植株、器官、细胞、组织等的离体培养。二、植物细胞工程研究的意义1、基础理论研究

试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题）。2、农业生产应用研究

无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株。

组织培养三、植物细胞工程的理论基础1902年，德国科学家Haberlandt提出细胞的全能性假说1943年，美国科学家White正式提出植物细胞具有全能性的学说。1958年Steward通过培养胡萝卜根悬浮细胞诱导出完整植株，证实植物细胞全能型理论基本概念植物细胞全能性（plantcelltotipotency）指植物体的任何一个细胞都携带有该植物的全部遗传信息，细胞经分裂和分化后仍具有产生完整植株的潜在能力或特性。分化细胞如何实现全能性？1、一个已分化的细胞要实现全能性一般要经历两个过程：脱分化和再分化2、实现全能性必须满足的条件：具有较强全能性的细胞从植株组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体状态赋予离体细胞一定的刺激，包括营养物质、植物激素、光照、温度、酸碱度等等。一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞的现象称为转分化细胞分化（differentiation）细胞分裂过程中，细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程。脱分化（dedifferentiation）：在组织培养时，放在一定的培养基上后，外植体的细胞转变成胚性细胞，从而获得不断分裂的能力。

即由已高度分化的、失去分裂能力成熟细胞回复到具有分裂能力的分生细胞组织或胚性细胞状态的过程叫脱分化。

再分化（redifferentiation）：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在一定条件下，重新恢复细胞分化能力再转变成具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团或组织胞，并进一步发育成完整植株。外植体（explant）：进行体外组织培养时被研究或被培养的那部分材料。愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培养中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的，无组织结构、松散的细胞团。

是高度分化的细胞经脱分化后，细胞分裂增殖形成的组织。即细胞脱分化的产物。草莓花药愈伤组织草莓叶片愈伤组织波萝愈伤组织烟草暗培养愈伤组织再生植株的发生（再分化）器官发生发生途径体细胞胚发生1、器官发生植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的过程。器官发生形成再生植株大体上有三种方式：

第一种方式是先芽后根

第二种方式为先根后芽

第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株草莓愈伤组织诱出不定芽寒兰根诱导不定芽草莓愈伤组织诱出不定芽和根2、胚状体发生离体培养组织形成类似于种子的胚的结构，同时产生芽端和根端的结构，称为胚状体。胚状体（embryoid）的特点：1、不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生。2、不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物。3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构植株再生成熟细胞再生植株胚状体发生器官发生愈伤组织分生细胞脱分化分裂再分化离体条件下细胞脱分化和再分化分为三个阶段：诱导期：外植体接受外界条件刺激，改变原有的代谢，距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质增多等细胞恢复到分裂能力状态。分裂期：被启动的细胞全面的进行活跃分裂分化期：即形成期，出现组织分化第二节、植物组织培养的一般条件一、培养基基本组成无机盐；碳源和能源；维生素；氨基酸和有机附加物生长调节剂（植物激素）琼脂1、无机盐类组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；大量元素（浓度>

0.5mmol/l),N、P、K、Ca、Mg微量元素（浓度<

0.5mmol/l)FeMnCuZnMommol/l是国际通用单位；但也经常有用mg/g表示这些元素以怎样的方式添加呢2、碳源和能源糖类:既可作为C源，又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖2-5%

。3、维生素常参与酶的合成及蛋白质、脂肪代谢等生命活动。常用的维生素B族类：包括VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、VH(生物素)、VB9（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。

肌醇：化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，但它在糖类的相互转化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响。4.氨基酸和有机附加物氨基酸主要作为氮源提供，常用的有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸等。有机添加物主要有：椰子汁、麦芽汁、香蕉泥、土豆泥、苹果汁等。注意：有机添加物根据需要添加，并不是所有的都要添加。5、植物激素

生长素auxin

吲哚乙酸（IAA）。赤霉gibberellinGA细胞分裂素cytokininCTK

脱落酸abscisicacid，ABA乙烯ethylene;etheneETH

生长素类：在组培中用于诱导细胞的分裂和根的分化。常用的有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。溶于95%的酒精或0.1mol/LNaOH溶解，常用量0.05-5mg/L细胞分裂素类：促进细胞分裂和诱导芽的分化。

常用的有KT(激动素)、6-BA(6-卞基腺嘌呤)、玉米素等。溶于0.5-1mol/LHCl溶解或稀薄的NaOH,常用量0.05-10mg/L植物组培常用激素及其作用

一般情况下生长素浓度约等于细胞分裂速浓度愈伤组织生长生长素浓度大于细胞分裂速浓度促进生根生长素浓度小于细胞分裂速浓度促进生芽6、琼脂一种海藻多糖累物质，并非一种必需成分，一般使用浓度0.7%~1%。作用：凝固培养基，支撑培养材料。其他附加物：Vc、活性炭、PVP、抗坏血酸等作用，防止愈伤组织褐化，活性炭吸收代谢的有毒物质等。二、常用培养基类型MS和B5培养基MS培养基是1962年Murashige和Skoog发明的。B5培养基MS培养基成分组成培养基的配制市售粉末直接溶解或者如MS培养基，用储备液稀释后混合然后加入3％的蔗糖，加入琼脂，溶解定容,调节PH约5.8,分装入各瓶，牛皮纸封口，121℃，高压灭菌约15分钟。加热易分解的激素等要无菌水配制，过虑除菌，然后与灭菌过的培养基混合。例如GA3、IAA、ABA、玉米素加热易分解。思考：选择培养基时激素的浓度怎样确定？正交实验NAAumol/l

BAP(umol/l)00.52.551000.52.5510（三）、培养条件PH值一般5.5~6.0温度，一般24℃～28℃光照，光强湿度一般80％1、培养基的物理性质固体、液体培养的选择；培养基中琼脂的量很重要。2、光照包括光照时间，光质，光强等，愈伤组织的形成虽然不需要光照提供能量，但光照对其是一种诱导效应。3.温度、湿度及气体温度过高或过低对器官发生的数量和质量均有影响，一般24℃～28℃4、培养基的pH一般5.5~6.0。培养基的 pH可通过影响培养物的营养吸收、呼吸代谢、DNA合成，生长调节物质进出细胞等直接或间接的影响愈伤组织的形成及器官再生。

第三节、植物组织培养的基本过程（一）培养基的选择与配制（二）材料采集与消毒（三）制备外植体（四）接种（五）培养材料采集

组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。材料的消毒（1）先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。（2）在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。（3）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.1％升汞水中消毒约10分钟。（4）取出后用无菌水冲洗4-5次。常用的灭菌药物、种类、浓度及效果外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液中加入1～2滴的表面活性物质，例如吐温80或吐温20，为什么？

消毒剂主要是用来对外植体消毒的，使用后外植体表面会有残留，若不用无菌水冲洗，会严重组织和细胞，影响外植体体外培养，另外，外植体已是消毒过的，若不用无菌水冲洗而用蒸馏水的话，会使得外植体再次染菌。

表面活性物质可以是外植体表面湿润，也可以使外植体与消毒液充分接触，另外，表面活性剂可以除去外植体表面的脂溶性物质，使得消毒剂更好发挥消毒作用。制备外植体

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。

接种将经过消毒，灭菌过的活的外植体，按照不同的要求移植到培养基上培养的过程。接种过程要严格按照无菌操作，预防污染外植体的培养1、固体培养最常用的方式，一般使用凝固剂琼脂（浓度0.7%~1%）2、液体培养分为静止培养和振荡培养3、饲养培养指用处理过的无活性的或分裂很慢的、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。4、看护培养指一块活跃的愈伤组织来看护单个细胞，使其分裂和增值的一种培养方法。5、微室培养为单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，可对单细胞的生长和分化，细胞分裂的全过程及胞质环流的规律等进行活体连续观察。1、内在因素外植体的遗传性状裸子植物、蕨类植