分解尿素的细菌

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题二微生物的培养与应用一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶3、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌二.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照二、研究思路(一)筛选菌种1实例：寻找耐高温的DNA聚合酶PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。启示：自然界中寻找目的菌种时要根据它对_______________，到相应的环境中去寻找。生存环境的要求耐高温的酶耐高温生物体耐高温环境（热泉、火山口）寻找寻找Taq细菌筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，耐热的Taq细菌保留下来。（一）、筛选菌种1.自然界中目的菌株的筛选(1)依据:根据它对

的要求,到相应的环境中去寻找。(2)实例:PCR技术中用到的耐高温的

,就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中分离到的。2.实验室中目的菌株的筛选(1)理论依据人为提供有利于

生长的条件(包括

、温度、pH等),同时

或

其他微生物生长。生存环境TaqDNA聚合酶目的菌株营养抑制阻止2）实例:(本课题使用的培养基）①从物理性质看此培养基属于哪类？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素②该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？固体培养基培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。3选择培养基：在微生物学中，将允许______________________，同时_________________________生长的培养基。特定种类的微生物生长抑制或阻止其他种类微生物结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。㈡.统计菌落数目：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M

1个菌落←1个活菌2原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。1常用方法：稀释涂布平板法。其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法，还可以用过滤膜法3计算公式：4

注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板上，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因：当两个或多个细菌连在一起，平板上只观察到一个菌落。看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值实例分析P22

第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B1对照实验:㈢.设置对照：2.目的:是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验。排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106

倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误

(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案二：结果预测：由其他同学用与A同学相同土样进行实验①如果结果与A同学一致，则证明A无误；②如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

三.实验的具体操作

1土壤取样1)取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多.2)土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。3)取样部位：距地表约3～8cm的土壤层。2.样品的稀释1)稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300

，便于计数。①测定突土壤中的细菌:一般选104、105、106的稀释液②放线菌：103、104、105的稀释液进行平板进行培养。进行平板进行培养。③测定土壤中真菌：一般选102、103、104稀释液进行平板进行培养。3）原因：不同微生物在土壤中含量不同2样品稀释涂布

每个稀释度均用3个选择培养基。稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/g）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性的提供选择培养的条件。3取样涂布4微生物的培养与观察选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

1）培养：不同微生物往往需要不同培养温度。①细菌：30～37℃培养1～2d②放线菌：25～28℃培养5～7d③霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d2观察2）.菌落的特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。1）观察方法：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目微生物的培养与观察四、操作提示1.无菌操作1)取土样的用具在使用前都需要灭菌2)实验操作均应在火焰旁进行。2.做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。课外延伸在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）

A.在液体培养基上进行B.至少接种一种细菌

C.接种一个细菌D.及时补充消耗的营养物质2.使用选择培养基的目的是（

）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素课堂练习A

CD4.下列说法不正确的是（）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1