张苗 高速逆流色谱原理及应用

高速逆流色谱

Thehigh-speedcountercurrentchromatography(HSCCC)班级：工业分析01主讲人：余俊同组者：汪雅洁王星杨云张茜

1高速逆流色谱发展2高速逆流色谱原理及工作方法3高速逆流色谱发展过程中形成的新技术新方法4高速逆流色谱的应用及展望摘要摘要：高速逆流色谱是近年发展起来的，不使用固定相载体的新型液液逆流色谱。本文介绍了高速逆流色谱的工作原理，HSCCC在的分离方面具有很大的优势，具有非常广阔的应用前景。本文主要综述了HSCCC在天然产物、生物医药和其他方面的应用情况。Abstract:Thehigh-speedcountercurrentchromatography(HSCCC)isdevelopinginrecentyearwhichwithoutfixedcarrier.Theworkprinciple，characteristicsofHSCCCwereintroducedinthispaper，whichsummarizedtheapplicationandpurificationofHSCCConthenaturalproduct，biomedicineandsoon，especiallytheapplicationonthefieldsofpurificationandisolationnaturalproduct引言高速逆流色谱是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。它相对于传统的固-液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。高速逆流色谱的发展高速逆流色谱(HSCCC)是在1982年，美国国立卫生院的一个教授首先研究和发展起来的一种不同于传统液相色谱法的现代色谱分离制备技术。作为一种新的色谱技术，HSCCC分离系统可以理解为以螺旋管式离心分离仪代替HPLC的柱色谱系统。HSCCC不使用固相载体作固定相,克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。由于不需要固定相，HSCCC技术具有进样量大、无不可逆吸附等优于其他色谱技术的优点，此项技术已经被广泛地应用于医药、环境、化工等领域。DCCC（液滴逆流色谱）缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．DisadvantageLowflowrateLongseparationtime

一、高速逆流色谱原理

高速逆流色谱（HSCCC）高速逆流色谱是建立在一种特殊的单向性流体动力学平衡的基础上色谱技术，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)。流动相不断穿过固定相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，在固定相中分配比例大的后被洗脱。

HSCCC液－液分配色谱利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？流体静力学平衡(HSES)流体动力学平衡(HDES)逆流色谱的基本体系示意图高速逆流色谱(HSCCC)的原理固定相的保留原理如上图所示，螺旋柱中注满差不多相等体积的两相溶剂（见右侧试管），在螺旋柱的匀速转动下两相溶剂受到“阿基米德螺旋力”的作用，竞争性地朝首端移动。不久，两相在螺旋管地首端建立一种流体动力平衡，按一定比例共存，而这种情况发生在每一圈螺旋柱内。并且任何一相的超量都会被推向螺旋管的尾端一侧。固定相的保留利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维离心力场形成的单向性流体动力学平衡（HDES）从而实现流动相高速移动时固定相的保留混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部，轻相在内部

以1000转/分的速率进行旋转，在二维力场的作用下分离管柱内混合和传递的频率可达到17次/S，从而实现高效的分离K＝Cs/Cm

CsCmHSCCC的工作流程一、溶剂体系的准备二、柱系统的准备三、样品溶液的准备和进样四、洗脱方式五、检测高速逆流色谱工作方法溶剂体系的选择原则⑴不造成样品的分解与变性，且不与之发生反应；⑵对样品有足够高的溶解度；⑶样品在溶剂体系中有合适的分配系数值(K应在0.5-2之间)；⑷溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相,以免浪费溶剂；⑸固定相能实现足够高的保留，且要满足一定的要求(保留值越大峰形越好)。因而准确测定待分离组分在两相中的分配系数，便可选择出合适的溶剂系统。溶剂体系和溶剂系统溶剂体系选择选取一个合适的溶剂体系步骤：(1)通过TLC或者HPLC预测被分离物质的极性。(2)根据极性选择合适的分离体系。(3)如果得知与被分离物质极性相似物质的分离体系，可以借鉴。在选择溶剂系统时就需要测定组分的分配系数,而分配系数测定常采用高效液相色谱法或薄层色谱法，这两种方法都能够较准确地测出特定组分的分配系数值。HPLC法是将适量的样品分别溶于已平衡的两相溶剂，待分配平衡后，进行HPLC的测定，通过得到的色谱峰面积可精确计算出样品在两相间的分配系数。薄层色谱法则是利用样品在等体积上下相中分配平衡后用薄层色谱展开,通过薄层色谱得到的斑点判断组分的分配情况。不同的体系，有着不同的平衡时间(不同溶剂系统中，从两相溶剂系统的上相与下相溶剂混合时，直到两相系统达到完全分层的时间)，其影响着系统的分离效能，与固定相的保留率密切相关。如果要同时分离多种物质，首先要预测被分离物质的极性，根据极性的大小来选择分离体系。如果被分离物质的极性都比较大,可以选用醋酸乙酯体系；如果被分离物质一部分极性大，一部分极性中等可以选用氯仿体系；如果被分离物质一部分极性中等，一部分极性较小可以选用正己烷体系；如果被分离物质极性都较小可以选用石油醚体系。逆流色谱的独特优势优势

高效提纯：

能将样品有效成分一步分离提纯到99％以上。

大制备量：半制备型仪器可达克量级进样。

低使用成本：无耗材费用投入，后续维护成本低。高科研价值：结合传统分离技术，提供现代最新分离技术平台。

易工艺放大：

工艺重复性100％，易实现从微克级到百克级工艺放大。高回收率：无固体载体，避免吸附造成变性及损失，样品理论回收率100％逆流色谱与传统色谱的比较相对柱层析

分离效率高，实验周期短封闭性操作，无溶剂挥发造成污染简化繁琐的实验步骤工艺重复性高无死吸附，回收率高相对制备HPLC一次进样，制备量大工艺重复性高前处理简单无耗材消耗，实验成本低无死吸附，回收率高二、高速逆流色谱优点

不用固态载体的高效液-液分配色谱技术不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100%样品负载能力强，制备量大，重现性好操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件操作简单，无需太多样品前处理

三、影响因素高速逆流色谱仪的转速、流动相流速、进样体积是影响提取效果的主要因素。通常情况下:(1)转速越高,越易产生乳化现象;(2)流动相流速越大,固定相流失加重;(3)进样量太大,峰间距变窄,峰形变宽。在选定了溶剂体系后,有时需要对三个仪器运行参数(转速,流动相流速,进样体积)进行正交试验,以确定最佳分离条件。四、HSCCC的最新发展

近年来，分析型HSCCC的柱系统向微型化发展。螺旋管体积可达3~5mL，柱子内径可以小到0.3~0.4mm[23]。基于常规的HSCCC技术的完善，多种HSCCC技术也得到了发展。如pH-区带精制逆流色谱(pH-zone-refiningCCC)，HSCCC与质谱(MS)联用等1高速逆流色谱-质谱（HSCCC/MS）联用

基于高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）联用技术的日益成熟，发展了HSCCC与MS联用技术。这种联用技术的发展解决了HSCCC由于固定相的流失而使得流出液乳化，导致检测器的灵敏度降低和峰形变宽的问题。

Oka设计了T型连接器，解决了HSCCC与MS的接口问题，发现联用技术不影响HSCCC的分离和质谱的分析，而且适用于极性范围较宽的被分析物。Rinehart等首次报道HSCCC与电喷雾质谱(ESIMS)联用技术，ESIMS作为一种可以连续检测的分析检测器，有很高的灵敏度，它可以利用软电离技术克服离子化过程中因热不稳定样品分解而出现的问题，同时，联用技术对复杂样品有很强的溶解能力，适用范围更广，广泛地被用于天然产物、药物、蛋白质等分子量大、极性强、热不稳定和物资外吸收物质的分析。2高速逆流色谱-高效液（HSCCC/HPLC)联用

HSCCC/HPLC联用技术的发展，使样品分离和检测过程同步进行，减少了检测过程的中间环节，避免了样品在转移过程中造成的污染。样品经过HSCCC分离后，若需采集样品进行HPLC检测，流经T型分流阀部分的馏分被收集，流经六通阀的另一部分可以通过转换六通阀来采样检测。3高速逆流色谱-高速逆流色谱（HSCCC/HSCCC）联用

HSCCC可以单独使用，也可以两台串用，有研究者比较了高速逆流色谱仪单台和串联使用对相同的溶剂系统和分析样品的分离能力，发现双机串联的分离能力是单台的四倍4离子对逆流色谱技术

离子对逆流色谱(ion-pairingCCC)需要在固定相中加入配位体，以提高其保留值。实验中使用较多的是DEHPA(二乙基己基磷酸盐)，广泛应用于分离稀土元素、儿茶酚胺和多肽。它为分离同系物，结构相似的化合物提供了有效的途径，相当于传统HSCCC的柱容量增大十倍，且分离得到的物质纯度高，分离时间短。二元模式逆流色谱传统的高速逆流色谱是将固定相保留在螺旋管内，流动相从螺旋管的一端注入，另一端流出，而二元模式逆流色谱采用的是螺旋管的两端同时流入，又同时流出，这样才真正实现了两相对流。它以同一两相分配溶剂系统洗脱，既可用于正相洗脱也可用于反相洗脱，因而大大增加了HSCCC对化合物极性范围的适应性，普遍的应用于天然产物的分离精制。二元逆流色谱的优点是：分离速度快，分离效率更高，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的困惑，因而可以应用于蛋白质的分离。6手性逆流色谱技术

随着科学不断发展，逆流色谱技术应用范围逐渐拓展。早在1995年，Ito博士等已提出用逆流色谱分离外消旋对映体手性化合物。例如溶剂系统采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水，在固定相加入手性选择体N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，用系列N-(3,5-dintrobenzoyl)-D,L-氨基酸作检测样品，可以实现良好的分离。pH区带逆流色谱

pH区带逆流色谱是20世纪90年代发展起来的逆流色谱技术，它的发展扩展了高速逆流色谱的应用空间。它是通过高速逆流色谱的固定相和流动相中加入一对试剂例如在有机固定相中加入三氟乙酸，流动相中加入氨水，三氟乙酸为保留剂，流动相以一定的流速穿过固定相，由于酸碱反应,最后达到平衡。以有机酸在固定相和流动相的浓度比标度分配系数(保留剂的分配系数)、溶质(分离物或分析物)的系数与标度值的差异决定了出峰时间，从而实现分离。该逆流色谱技术因系根据分析物的pKa

和疏水性产生特性的pH-区带，因此称为pH-区带逆流色谱。由于它是根据物质的解离常数和疏水性的不同而实现的分离，因而主要用于对生物碱、有机酸、氨基酸及酸碱衍生物的分离。

它的优点是：进样量大；样品分离纯度和分离效率高；对于无紫外吸收的化合物也可以通过pH值得变化实现在线监测的优点，并在分离时，可以将微量组分浓缩便于检测。双向逆流色谱双向逆流色谱（dualcountercurrentchromatography,DuCCC)其两相溶剂相互逆向交错从柱子的一端流到另一端，实现真正的逆向流动，两相都为流动相，没有固定相存在。特点：能够始终保持柱中两相溶剂是新鲜干净的，非常适用于复杂混合物的制备型分离，能够同时使极性组分和非极性组分实现高效分离，通常非极性组分洗脱在弱极性的有机相中，极性组分洗脱在极性较强的含水相中，除此之外，其分离效率和上样量也很显著，不存在固定相饱和问题。泡沫逆流色谱泡沫CCC所采用的两相流体中一项是液体，另一项是气体。它的分离主要是基于泡沫对水溶液样品的亲和力。优点：1.能够对具有泡沫性的样品进行富集和浓缩；2.对生物样品几乎没有分解和失活；3不存在由于固体支撑体吸附样品损失；4.样品不会被污染；5.分离后易于回收；6.操作成本低五、高速逆流色谱应用

高速逆流色谱技术的应用领域1高速逆流色谱在中药现代化中的应用2高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用3高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用4高速逆流色谱在食品行业中的应用5高速逆流色谱在化学合成中的应用6高速逆流色谱在生物领域中的应用7高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用高速逆流色谱在中药现代化中的应用成药质量控制指纹图谱指导原药材种植/GAP基地建设单体化合物用于制药中间体的质量控制HSCCC在中药指纹图谱中的应用中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段（光谱和色谱）得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法2000年8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国FDA及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷（比如HPLC法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）高速逆流色谱法是中药指纹图谱发展的一个新方向B1B2B3A1A2A3HSCCC图谱HPLC图谱不同产地丹参提取物

实例HSCCC在天然产物分离中的应用生物碱类生物碱是重要的天然含氮化合物，对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。近年来，用HSCCC已成功分离了多种生物碱。分离生物碱成分常用的溶剂体系是正已烷-乙酸乙酯-甲醇(或者乙醇、正丁醇)-水体系及三氯甲烷-甲醇-水体系[6]。程悦[7]等应用高速逆流色谱法分离制备了苦茶中的苦茶碱。以正己烷-二氯甲烷-甲醇-水(体积比为1：5：4：2)为两相溶剂系统，在主机转速800r／min、流速2.0mL／min、检测波长278nm条件下进行分离制备。所得流分经高效液相色谱法检测，与对照品进行比较，并通过质谱、核磁共振氢谱、碳谱鉴定化合物的结构。结果表明，从2.22g苦茶总生物碱提取物中分离得到了3个化合物，分别为可可碱5mg，苦茶碱389mg，咖啡碱41mg，纯度均在99％以上，系首次采用高速逆流色谱法对苦茶中的苦茶碱进行分离。该法具有简便、快速的优点。黄酮类黄酮类化合物多存在于高等植物和蕨类植物中，常以游离或与糖结合成苷的形式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。分离极性较大的黄酮苷类成分时，一般应用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶剂系统，并适当增加体系的极性。分离游离的黄酮类化合物常用氯仿-甲醇-水体系。利用HSCCC技术能够有效地分离黄酮类化合物。已见报道用氯仿-甲醇-水(4：3：2)体系分别分离了陈皮和沙棘中的橙皮苷和茨非醇[9]；用氯仿-甲醇-水(4：3：2)体系曾从芫花总黄酮中分离得到羟基芫花素、洋芹素、木樨草素”[10]；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：3：l：6)体系从红茶分离了茶黄素[11]；用氯仿-甲醇-水(10：7：3)分离了雪莲中的黄酮类成分[12]；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9：l：5：5)从掌叶大黄的根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素”[13]。用乙酸乙酯-正丁醇-水(2：l：3)溶剂系统，可以从葛根粗提物中进一步分离包括葛根素在内的七个异黄酮化合物[14]木脂素和香豆素类报道用正己烷-甲醇-水(6：5：5)溶剂系统从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分-schisanhend及其乙酸化物[15]；氯仿-甲醇-水(13：7：8)的两相体系分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素和7-羟基香豆素[16]。多酚类物质许多研究表明，茶叶中的多酚类物质经微生物代谢后能产生活性更高的物质，Greenwalt等报道经发酵的茶比绿茶具有更高的抗菌活性黑茶60%乙醇提取物。对活性流分D-7采用溶剂系统：乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水-乙酸（4∶1∶1∶4∶0.1，v/v）固定相（上相）流动相（下相）进行了HSCCC分离，得到化合物1、2，纯度均大于95%，经结构鉴定确定二者分别为牡荆苷、异牡荆苷。环脂肽类抗生素

本实验采用高速逆流色谱分离技术制备达托霉素。上相为固定相，分离温度为二十五摄氏度。水:乙腈：三氟乙酸（65∶35:0.1）为流动相，检测波长为214nm。分离制备达托霉素的纯度大于94%。实验表明了高速逆流色谱可以用于达托霉素的分离。菌株中的除草活性物质目前人们研究的重点以微生物源除草剂为主。与植物相比,微生物能够产生更多具有生物除草活性的化合物。应用高速逆流色谱法实现对小孢拟盘多毛孢菌株代谢产物中除草活性物质的首次分离。以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(4:5:4:5,V/V/V/V)为最佳的两相溶剂体系,上相(水相)为固定相,下相(有机相)为流动相,正相洗脱。实例1大黄有效成分的分离HSCCC条件：固定相：乙醚流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH梯度洗脱(500min内,由100:0-0:100)流速:2.0mlmin-1转速：800rpm样品量：120mg粗提物固定相保留：40%机型：TBE-300AⅠ：rhein（大黄酸）19mgⅡ:cinnamicacid（苯乙烯酸）19mgⅢ:emodin（大黄素）18mgⅣ:aloe-emodin（芦荟大黄素）14mgⅤ:chrysophanol（大黄酚）10mgⅥ:physcion（大黄素甲醚）6mg纯度均在98％以上JournalofChromatographyA,2004,Volume1052,Issues1-2,Pages217-221HSCCC在分离中药单体中的应用（蒽醌类）

实例2蛇床子有效成分的分离HSCCC条件：溶剂系统:

石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水流动相：梯度洗脱0-150min:5:5:5:5下相150-250min:5:5:6:4下相250min后:5:5:6.5:3.5下相流速:2.0mlmin-1转速：800rpm样品量：150mg粗提物机型：TBE-300A固定相保留：60%Ⅰ：花椒毒素

95.0％7.6mgⅡ:异茴芹素

99.6％7.6mgⅢ:佛手苷内酯

99.7％9.7mgⅣ:欧前胡素

100％60.5mgⅤ:蛇床子素

100％50.6mgⅥ:未知化合物

98.1％10.2mgJournalofChromatographyA,2004,Volume1055,Issues1-2,71-76

HSCCC在分离中药单体中的应用（香豆素类）

JournalofChromatographyA,1102(2006)44-50实例3白花败酱异戊烯基黄酮的分离溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯－甲醇-水(5:6:6:6)流动相：下相流速:1.0-2.0mlmin-1转速：850rpm样品量：400mg粗提物固定相保留：65%分离温度:25C机型：TBE-300AⅠ:orotinin

（牡荆苷）99.2％

38.2mgⅡ:orotinin-5-methylether98.5％

19.8mgⅢ:licoagroachalconeB97.6％21.5mgHSCCC在分离中药单体中的应用(黄酮类)

实例4吴茱萸生物碱的分离溶剂系统:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:7:5)流速:2.0ml/min转速：900rpm样品量：180mg粗提物固定相保留：50%机型：TBE-300AⅠ:吴茱萸碱98.7％

28mgⅡ:吴茱萸次碱98.4％

19mgⅢ:吴茱萸新碱96.9％21mgⅣ:1-methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone.98.0％

16mgⅤ:1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone97.2％12mg

J.Chromatogr.A,2005,vol1074/1-2pp.139-144HSCCC在分离中药单体中的应用（生物碱类）

芦荟苷B芦荟苷A芦荟未知物芦荟提取物HSCCC分离图谱丹参提取物的HSCCC分离图谱丹酚酸B沙棘提取物的HSCCC图谱异鼠李素山奈酚槲皮素高车前素未知物泽兰黄酮荔枝草提取物的HSCCC图谱小结：

HSCCC在中药中各类单体的制备均有应用，经过简单的前处理（提取、萃取或大孔树脂柱）后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替代的分离方法。溶剂体系：石油醚-丙酮-水

（3:3:2,v/v）

样品：250mg环孢菌素粗品

检测条件：ELSD环孢菌素A－98.6%，90.2%(收率)环孢菌素C－99.3％，85.0%(收率)环孢菌素B－98.7％，88.5%(收率)环孢菌素D－98.5％，86.3%(收率)实例1环孢菌素粗品

HSCCC在抗生素分离纯化中的应用溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.5％氨水（3:7:5:6,V/V），检测器：ELSD；进样量：300mg红霉素A和C含量均在98％以上实例2红霉素HSCCC在抗生素分离纯化中的应用实例1藤黄酸异构体的分离溶剂系统:正己烷-甲醇-水(5:4:1)流动相：下相流速:2.0mlmin-1转速：900rpm样品量：50mg固定相保留：50%分离温度:25CA.gambolicacid97.2%

B.epigambolicacid97.5%闭合回路系统JournalofChromatographyA,2006,Volume1127,298-301

HSCCC在异构体分离纯化中的应用

实例1利用HSCCC分离标准蛋白质混合物123溶剂体系：PEG1000-磷酸盐体系-水＝14-16-70(%,w/w)样品：1mg

细胞色素C、20mg

溶菌酶、5mg血红蛋白1.CytochromeC;2.Lysozyme;3.Hemoglobin

(反转出峰，上相为流动相)色谱，2005,Vol.23No.112～17HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用溶剂体系：PEG1000-磷酸二氢钾-水＝15-17-68(%,w/w)

样品：1mg细胞色素C、8mg肌红蛋白、20mg溶菌酶1.CytochromeC;2.Myoglobin3.Lysozyme实例2利用HSCCC分离标准蛋白质混合物HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用从上面这些实例可以看出，HSCCC作为一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的应用空间。参考文献[1]叶琼仙,尹胜,周盈利.白叶单枞黑茶降血糖活性成分的高速逆流色谱分离.食品工业科技.2013,36（6）:84-107[2]石雪萍,吴亮亮,张卫明.高速逆流色谱法分离花椒中的黄酮化合物.2013,34（12）:6-10[3]刘雪辉,王振,吴琪.高速逆流色谱法分离玫瑰茄中的花色苷.现代食品科技.2014.13（1）:190-194[4]姜永慧.利用高速逆流色谱分离制备达托霉素.科技论坛.2014,91[5]王珺瑫,郑超,张利辉.高速逆