人工细胞外基质与多种细胞培养

组织工程支架材料东南大学生物科学与医学工程学院生物电子学国家重点实验室黄宁平nphuang@2011-5-16√组织工程支架材料√生物材料的表面工程支架设计与制备技术组织工程支架材料展望理想的组织工程支架应具备以下功能:1）良好的生物相容性使细胞可黏附和增殖，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织的功能；2）可降解性及合适的降解速率，当移植的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配；3）合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通的孔形态，以利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的长入；4）高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系，以利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子；5）与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；6）便于加工成理想的二维或三维结构，可以获得所需的组织或器官形状，易于重复制作，而且移植到体内后能保持原有形状。组织工程支架材料主要包括：（1）天然可降解高分子材料。如胶原（collagen），其本身就是天然骨的组织成分。壳聚糖（chitosan），是甲壳素的衍生物。还有明胶、琼脂、葡聚糖、透明质酸。降解产物易被机体吸收，但强度和加工性能较差，降解速度无法调节。（2）天然可降解无机材料。例如珊瑚是天然动物的骨骼，其中99％是磷酸钙。再如，珊瑚羟基磷灰石（CHA）。它们都具有天然珊瑚的多孔结构，有较好的孔隙率。能和靶细胞很好的黏附，而不影响增殖、分化、成骨。但加工困难。（3）合成可降解高分子材料。常用的可降解合成高分子材料有聚乳酸[poly（lacticacid）,PLA],聚乙醇酸[poly(glycolicacid),PGA],聚己内酯(polycaprolactam,PCL)等。这类材料的降解产物可在体内代谢排除，对机体无害，可塑性较好。（4）合成可降解无机材料。常用的主要有磷酸钙水泥(calciumphosphatecement,CPC)，羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP),生物活性陶瓷如生物活性玻璃陶瓷(biologicalactivityceramicglass,BCG),细胞外基质陶瓷类材料等。（5）复合材料。常用的有聚乳酸－羟基磷灰石

生物材料表面对细胞的影响：生物材料表面能：表面能较高（较亲水）的表面更有利于细胞的黏附和铺展。生物材料表面的蛋白吸附能力：生理液体中含大量白蛋白和少量ECMs蛋白质（纤连蛋白FN、玻连蛋白VN和层连蛋白LN等）。生物材料表面电荷：在正电荷生物材料表面，细胞的黏附呈现连续性。

生物材料表面的亲水－疏水平衡：疏水性表面对蛋白质的吸附能力较强。生物材料表面的拓扑（图案）结构：细胞根据材料表面的拓扑形貌而取向生长。生物材料表面的生物活性：生物材料表面具有整连蛋白认同的配体是细胞识别并接受生物材料为“自体”ECM的关键。组织工程研究现状组织工程研究的器官及其部分产品支架设设计与与制备备技术术1.天天然然高分分子材材料支支架：：蛋白质质支架架（胶胶原支支架、、明胶海海绵、丝纤纤维基基材））多糖支支架（（壳聚聚糖-阳离离子多多糖、、海藻藻酸盐盐-存存在于于褐藻藻的阴阴离子子线性性多糖糖）蛋白质-多糖糖支架（明胶胶-海藻酸盐盐、壳聚糖－明胶胶）Preparationschemeofgelatinhydrogelsbythefreeze-dryingprocedure.冷冻干燥法制制备明胶海绵绵支架示意图图明胶海绵支架架FabricationofporousgelatinscaffoldsH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344明胶水溶液用用戊二醛交联联形成凝胶，，放置12h后用甘氨酸酸处理将水凝胶分别别在－20°C和和－80°C预冻12h（或在液氮氮中冷冻20min)冷冻干燥4天天明胶是胶原的的部分变性衍衍生物,由由胶原的三重重螺旋结构解解体为单链分分子而形成,可作为细胞胞培养的支架架以及生长因因子的控制释释放载体。Anopticalphotographofahydrogelfreeze-driedfollowingfreezingat-20℃and(b)aSEMmicrographofitshorizontalcross-section.SEMmicrographsofhorizontalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).-20℃,孔径250±120μm-196℃,孔径45±5μm-80℃,孔径85±35μmH.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344SEMmicrographsofverticalcross-sectionsofgelatinhydrogelsfreeze-driedfollowingfreezing(a)at-80℃and(b)inN2(l).迅速冷却时,冰晶将受到到外应力的作作用,而使它它们在明胶水水凝胶温度梯梯度方向上取取向.不同冷冻温度度条件下制备备多孔支架的的孔隙形态示示意图随温度梯度的的增大，支架架内部孔隙呈呈三维，二维维和一维结构构。-20℃-80℃-196℃-80℃-196℃H.-W.Kangetal.Biomaterials20(1999)1339-1344壳聚糖－明胶胶双层支架：：人工皮肤支支架皮肤为层状组组织,真皮层层由成纤维细细胞及其细胞胞外基质构成成,而表皮层层中的表皮细细胞所分泌的的角蛋白纤丝丝不断从增殖殖层分化为角角质层,以保保护皮肤,防防止水份流失失及细菌的侵侵入.壳聚糖－明胶胶双层支架：：人工皮肤支支架壳聚糖与明胶胶经戊二醛共共交联形成杂杂混聚合物网网络(HPN)凝胶,将将此溶胀水凝凝胶经冷冻干干燥可制备多多孔支架.将将装有水凝凝胶的培养皿皿直接放在-56˚C的的冷却板上,通过调整热热传导方式梯梯度控制样品品的预冻过程程.此时溶胀水凝胶底底部直接与冷冷却板接触,是直接热传传导过程;上部是与空气气的对流热传传导过程,属于间接热热传导过程.由于热传导导速率的不同同,将形成双双层支架,其其底层为致密层层(孔径较小小),上部为为疏松层,可用作人工工皮肤支架，，其透氧性优优异，能控制制蒸发水的损损失量，防止止外源性微生生物的侵入。。Thelamellarstructureofthebilayerscaffoldwithdifferentlocalmagnification:(a)100;(b)400;(c)1000:壳聚糖－明胶胶双层支架的的层状结构,致密表层的的孔径为0.43μm,疏松底层平均均孔径102μm.J.S.Maoetal.Biomaterials24(2003)1067–1074Keratinocytesculturedfor1weekonfibroblast－containingscaffoldsthathadbeenculturedfor3weeks:(a)H&E;originalmagnification×100;and(b)H&E;originalmagnification×400.角质形成细胞胞在成纤维细细胞培养3周周的支架上培培养1周后的的HE（苏木木素－伊红））染色照片J.S.Maoetal.JBiomedMaterRes64A(2003)301––308纤维粘结技术术Fabricationofnon-woven相分离技术术phaseseparation溶剂流延－颗颗粒沥滤法Solventcastingandparticularleaching（成孔剂析出出法）膜材层压法Membranelamination熔融模塑法Meltmoulding超临界流体技技术Supercritical-fluidtechnology（高压处理法法、气体发泡泡法）2.合成降降解聚合物支支架制备技术术溶剂流延－颗颗粒沥滤Solventcastingandparticularleaching将盐粒(用标标准筛筛分)分散于PLLA的二氯甲烷溶溶液中，使之之在玻璃培养养皿中成膜。。待溶剂挥发发后真空干燥燥，将膜浸入入水中，洗去去NaCl，即得到多孔孔膜。通过热处理(退火或淬火火)可以调节节PLLA膜的结晶度（（半结晶或非非晶态），调调节盐粒大小小和用量可控控制孔的尺寸寸及孔隙率.缺点是孔隙贯贯穿率低，必必须使用有机机溶剂，阻碍碍了水溶性生生物活性剂与与支架材料的的结合。SEMof90%porous75:25PLGAfoamsfabricatedbyasolvent-castingparticulate-leachingtechnique.Thefoamsexhibitedporesizesrangingfrom150–300μm(a),300–500μm(b),and500–710μm(c).Atopviewofapolymerfoampreparedwithsaltparticlesrangingfrom300–500μmandseededwithcells(22.1××105cells/cm2)revealslayersofosteoblastscoveringtheporessurfacesafter1dayinculture(d).IshaugSL,JournalofBiomedicalMaterialsResearch,Vol.36,17–28(1997)植入物孔径为为20μm时适于成成纤维细胞的的长入，20～125μμm时适合成成年哺乳类皮皮肤组织的长长入，而100～250μm适合骨骨组织再生。。采用溶剂流延延/盐颗粒沥沥滤技术可制制备87％～～91％孔隙隙率、孔径100～500μm的多多孔支架。采采用乳液冷冻冻干燥法可得得到孔隙率>90％、孔孔径20～200μm的的支架。相分离法/冷冷冻干燥法Phaseseparation/freezedrying用于制备组织织工程多孔支支架的相分离离法是指将聚聚合物溶液、、乳液或水凝凝胶在低温下下冷冻，冷冻冻过程中发生生相分离，形形成富溶剂相相和富聚合物物相，然后经经冷冻干燥除除去溶剂而形形成多孔结构构的方法。因因而，相分离离法又往往称称为冷冻干燥燥法，按体系系形态的不同同可简单地分分为乳液冷冻冻干燥法、溶溶液冷冻干燥燥法和水凝胶胶冷冻干燥法法。该法避免免了高温，有有利于生物活活性分子如蛋蛋白质生长因因子或分化因因子的引入和和控制释放。。乳液冷冻干燥燥将水与聚合物物溶液一起均均化得到油包包水乳液，并并浇铸到模具具中，冷冻干干燥脱除水分分和溶剂，得得到多孔支架架。支架孔隙隙率91-95％，平均均孔径13-35μm,大孔孔尺寸达200μm，孔孔表面积达58-102m2/g，为相连连的孔结构。。MC:二氯甲甲烷PolymerVol36,1995,837-842SEMsofPLGAscaffoldsusedininvitroproteinrelease.(a)Group1:poresize=58±2μm.(b)Group2:poresize=33±8μm.(c)Group3:poresize=65±5μm.Allscaffoldshadabout90%porosityandabout10m2/gspecificsurfacearea.PolymerVol36,1995,837-842改变参数（（如水体积积分数，聚聚合物质量量分数以及及聚合物分分子量）可可调控支架架的孔隙率率，平均孔孔径及比表表面积。3.快速速成型（Rapidprototyping,RP)又称固态自自由成型（Solidfreeform,SFF)虽然传统的的支架制造造方法应用用已经十分分广泛，但但存在致命命的缺点，，主要表现现为制造过过程人工操操作、使用用有毒的有有机溶剂，，很难制造造出与缺损损组织相匹匹配的外形形轮廓。使使用快速成成型技术（（RP）或或固态自由由成型制备备（SFF）方法来来制造组织织工程支架架，不但可可避免上述述缺点，而而且还可有有效结合CAD技术，实现现对支架结结构的优化化与仿生设设计，以及及对支架制制造过程的的精确控制制，可以设计出出宏观构造造与缺损组组织几乎完完全相同的的3D结构构物，可以以形成完全全通孔、高高度规则、、形态与微微结构具有有重复性的的支架.快速成型术术（RP））制备骨支支架，CT扫描患者者缺损骨的的数据信息息。（a））形成计算算机三维模模型；（b）把模型型引入RP软件系统统，将其按按指定路径径切割成层层层薄层；；（c，d，e）薄薄层的数据据指导RP机器通过过三维模型型结构层层层组装，构构建实体三三维支架；；（f、g）定制的的支架和细细胞构建都都符合头颅颅复杂的三三维轮廓.DietmarWHetal,JTRENDSinBiotechnology,2004,22(7):354-362光固化快速速成型术（Stereolithography

Apparatus，，SLA)选择性激光光烧结(selectivelasersintering,SLS)三维打印(threedimensionalprinting,3-DP)熔融沉积模模塑(fuseddepositionmodelling,FDM)SFF技术术中以光固固化快速成成型术（SLA）出现最早，应用也较较多。SLA采用用光敏树脂脂选择性固固化，层层层覆盖烧结结的办法制制成模具，，然后将支支架材料浇浇铸到模具具内，烧结结成型后把把模具脱除除，最终得到到一定孔径径和孔隙率率的三维支支架，而且且孔洞间也也相互连通通。在树脂槽中中盛满液态态光敏树脂，它在紫外激光光束的照射射下会快速固化。成型过程程开始时，，可升降的的工作台处处于液面下下一个截面面层厚的高高度，聚焦焦后的激光光束，在计计算机的控控制下，按按照截面轮轮廓的要求求，沿液面面进行扫描描，使被扫扫描区域的的树脂固化化，从而得得到该截面面轮廓的树树脂薄片。。然后工作作台下降一一层薄片的的高度，已已固化的树树脂薄片就就被一层新新的液态树树脂所覆盖盖，以便进进行第二层层激光扫描描固化，新新固化的一一层牢固粘粘结在前一一层上，如如此重复，，直到整个个产品成型型完毕。光固化快速速成型术（（Stereolithography

Apparatus，SLA)MSTL制制备的支架架模具的SEM图像像和最终成成型支架形形貌和内部部构造JongYK,JMicroelectronicEngineering,2007,84:1762––1765成纤维细细胞在3D支架上的的培养SEM结果。。（a）细细胞种植入入支架4天天后；（b）1周后后；（c））4周后JinWL.JMicroelectronicEngineering,2007,84:1702––1705选择性激光光烧结(selectivelasersintering,SLS)选择性激光光烧结常采用红外激激光束选择择性烧结聚聚合物或者者聚合物／／生物陶瓷瓷的复合材材料粉末来来形成材料料层。成型时，，先在工作作台上均匀匀铺设一层层粉末材料料，将其加加热至略低低于它的熔熔化温度，，然后高精精度的激光光扫描系统统按照二维维层数据的的信息，控控制激光束束的照射位位置和强度度，照射粉粉末层，粉末材料融融化后相互互黏结，形成一截截面层；然然后工作台台下降一截截面层的高高度，再进进行下一层层的铺料和和烧结，如如此循环至至堆积到所所需的支架架高度。SLS技术术适用于多多种原料，，包括类工工程塑料，，金属，陶陶瓷。SLS不使用用有机溶剂剂,但烧结会引起起高温.GriffithLGetal.Science295,1009(2002)三维打印（3D-printing)根据系统计计算机所设设计的支架架形貌，在在预先放置置粉末的平平台上，室室温下打印印喷头在CAD的控控制下沿X轴和Y轴轴方向运行行，同时喷喷头在粉末末的表面喷喷出黏结剂，黏结剂黏黏附临近的的颗粒形成成二维结构构；该二维维结构沿轴轴方向降低低，其上再再放置一层层粉末，重重复上述过过程，待制制备出符合合预先设计计形状的支支架后移去去未结合的的粉末。Scaffoldsmadeofastarch/chitosanblenddesignedandfabricatedviaa3Dprintingprocess.3D打印技技术制备的的淀粉/壳壳聚糖支架架,采用水水溶液作为为粘合剂.由于3D打打印是在室温条件件下进行,生长因子子等活性物物质可引入入到多孔支支架而不失失活.J.Biomater.Sci.PolymerEdn,Vol.12,No.1,pp.107–124(2001)Schematicillustrationofthefuseddepositionmodeling(FDM)process.熔融沉积模模塑过程示示意图熔融沉积模模塑(fuseddepositionmodelling,FDM)首先将待用用的支架材材料拉丝，，再放入融融化器中熔熔融，喷嘴嘴沿X轴轴和Y轴挤挤出聚合物物束材，并并通过沉积积构建支架架层模型，，沿Z轴方方向降低该该模型并重重复X轴和和Y轴的运运动即可层层层构筑三三维支架。。D.W.Hutmacher/Biomaterials21(2000)2529-2543VariationinFDM-fabricatedHDPEscaffoldmicro-architecturesproducedusingdifferentrastergapsettings(RG)andlaydownpatterns;RG=200mm(a)0°/90°,(b)0°/60°/120°and(c)0/36/72/108/144°;RG=500mm(d)0/90°,(e)0/60/120°and(f)0/36/72/108/144°.通过FDM技术可设设计制造出出具有完全全通孔网络络结构的3D支架,支架加工工过程完全全由计算机机控制,试试样重复性性好.FDM技术没有粉尘和和化学物质质污染。D.W.Hutmacher/Biomaterials21(2000)2529-2543静电纺丝纳纳米纤维在在组织工程程中的应用用利用外加电电场力使聚聚合物溶液液或熔体克克服表面张张力在纺丝丝喷头毛细细管尖端形形成射流,当电场强强度足够高高时,在静静电斥力、、Coulomb和和表面张力力的共同作作用下,聚聚合物射流流沿不稳定定的螺旋轨轨迹弯曲运运动,在几几十毫秒内内被牵伸千千万倍,随随溶剂挥发发,射流固固化形成亚亚微米至纳纳米级超细细纤维。目前已有超超过100种天然和和人工合成成高分子材材料被成功功地电纺成成纳米纤维维,所得单单根纤维的的直径从40-200nm,甚至可以以跨越10-10000nm的量级,即微米、、亚微米或或纳米尺度度范围。静电纺丝过过程示意图图J.M.Deitzeletal./Polymer42(2001)261–272PolymersolutionPolymerjetMetalcollectorVAmbientconditionsTemperatureHumidityProcessingconditionsAppliedvoltageFeedrateDistancefromneedletocollectorNeedlediameterSolutionpropertiesViscosity/ConcentrationConductivityElasticitySurfacetension静电纺纺丝技技术纤维直直径：：10nm-5µm平平均均孔隙隙率：：＞85%对材料料本身身和所所负载载物质质（包包括活活性蛋蛋白类类物质质）没没有影影响。。能够制制备直直径与与天然然ECMs(其其中胶胶原纤纤维的的直径径为50-500nm)相近近的连连续超超细纤纤维,因而而支架可可以最最大程程度地地仿生生人体体内ECMs结结构;(2)能够简简捷地地制备备各种种聚合合物支支架,支架架材料料可以以是单单一的的聚合合物,也可可以是是多种种聚合合物的的复合合体,并可可以在在支架架中引引入无无机粒粒子(如羟羟基磷磷灰石石等)、生生长因因子、、细胞胞调控控因子子甚至至活细细胞；；(3)制备的的支架架具有有较高高的孔孔隙率率和较较好的的孔道道连通通。通过过调节节加工工参数数,电电纺纳纳米纤纤维的的孔隙隙率可可达90％％左右右,能能够满满足细细胞生生长对对材料料孔隙隙率的的要求求,由由纳米米纤维维层层层堆积积而成成的结结构也也确保保了支支架具具有良良好的的孔道道连通通性。。此外外,纳米纤纤维具具有极极大的的比表表面积积。这些些都为为细胞胞的生生存提提供了了良好好的微微环境境,有有利于于细胞胞的粘粘附、、分化化、增增殖；；(4)通过过选择择适当当的材材料和和加工工参数数,可以获获得降降解率率可控控的纳纳米纤纤维支支架,并能能对材材料表表面进进行理理化修修饰,提高高支架架的生生物相相容性性;(5)通过过调节节溶液液浓度度、纺纺丝参参数等等可以控控制支支架的的厚度度、三三维结结构和和力学学性,很好好地支支持细细胞生生长.静电纺纺丝技技术的的优点点具有纳纳米结结构建建筑体体系的的支架架有巨大的的比表表面积积，有利利于吸吸附蛋蛋白，，提供更更多的的与细细胞膜膜受体体的连连接点点。纳米纤纤维支支架体体系与与微米米级支支架体体系培培养细细胞对对比图图A和和B分别别代表表细胞胞连接接在微微米尺尺寸的的孔洞洞和纤纤维上上。可可以看看出细细胞在在这种种微米米级别别的支支架上上黏附附似乎乎是培培养在在2D平面面上。。为了了培养养组织织细胞胞在3D环环境中中，孔孔和纤纤维尺尺寸必必须比比细胞胞显著著的小小.ABScience,2005,Vol310,1135-1138纳米纤纤维可可用于于模拟拟细胞胞外基基质(ECM)细胞在在ECM上上的生生长很很大一一部分分取决决于支支架材材料的的化学学特征征和物物理特特征。。纳米米纺丝丝技术术可以以通过过调节节材料料的特特异性性基团团（亲亲水、、疏水水基团团、特特异蛋蛋白吸吸附基基团））、物物理特特征（（硬度度、粘粘弹性性、韧韧性））以及及形成成的3D-ECM结结构（（孔隙隙率、、纤维维排布布、纤纤维直直径等等）达达到仿仿制天天然ECM结构构的目目的，，以利利于细细胞的的粘附附、生生长、、迁移移、分分化。。相对对其他他形式式的ECM，纳纳米纤纤维ECM具有有较高高的孔孔隙率率、仿仿真纤纤维蛋蛋白结结构和和形貌貌可控控性强强、设设备简简单、、投入入小等等特点点。小肠胶胶原蛋蛋白纤纤维结结构纳米仿仿真纤纤维结结构纳米纤纤维是是一种种三维维结构构，它它具有有直径径分布布宽、高高多孔孔性、、高比比表面面积，，因此此相比比于其其他结结构更更有利利于细细胞连连接。。2.有有利利于氧氧气和和营养养成分分的补补给渗渗透。。3.对对于于生长长因子子和其其他蛋蛋白或或药物物有极极好的的传送送性能能。4.这这种种结构构与人人体自自然的的细胞胞外基基质十十分相相似,适于于生物物响应应作为为组织织替代代品。。纳米纤纤维支支架作作为组组织工工程支支架的的优势势：学界研研究情情况国际纳纳米纺纺丝研研究机机构分分布SCI静电电纺丝丝论文文数量量统计计生物材材料的的纺丝丝据资料料显示示：现现有的的大部部分用用于组组织工工程的的材料料都已已被电电纺成成丝。。2001-2006报道的纺丝生物材料各种组组织所所适宜宜的纺纺丝材材料生物功功能材材料纺纺丝的的纳米米纤维维聚乙烯烯醇PVA壳聚糖糖CS聚乳酸酸PLA温敏性性纤维维PNiPAAm聚聚N异异丙基基丙烯烯酰胺胺Poly（（NiPAAm－co－styrene））PVP(聚N-乙乙烯基基吡咯咯烷酮酮)定向排排列的的纳米米纤维维中空TiO2纤维多孔PMMA纤维表面带羧基的PS纤维表面带磺酸基的PS纤维表面带氨基的PS纤维多孔及及表面面修饰饰的纳纳米纤纤维肝细胞胞在同同种材材料的的膜片片及纳纳米纤纤维上上的生生长膜纤维纳米纤纤维促促进肝肝细胞胞的生生长平滑肌肌细胞胞在定定向纳纳米纤纤维上上的生生长SEMImageCLSMImage平滑肌肌细胞胞（（SMC））黏黏附在在定向排排列的的纳米米纤维维上培养一一天后后对细细胞核核及肌肌动蛋蛋白染染色箭头为为纳米米纤维维定向向排列列方向向20mm5h10hSEMimageofthePLANanofibrous人骨髓髓间质质干细细胞SEMImage定向微米无序微米定向纳米无序纳米神经干干细胞胞培养养在PLLA2天天LSCMImagePLLA纤纤维神经干干细胞胞神经丝丝染色色照片片显示示神经突突在不同同程度度定向向排列列的PLLA纳纳米纤纤维表表面的的生长长情况况，G-I纳米米纤维维定向向程度度逐渐渐降低低。Alignmentofneuritesisdependentonthealignmentofunderlyingnanofibers.A–C:SEMimagesoffiberswithhigh(A),intermediate(B),orlow(C)alignment.G––I:NeuritesfromDorsalrootganglia(DRG,背根根神经经节)grownfor3daysonfibersofidenticalalignmentsasdepictedinA–C.CoreyJMetal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2007：：636-645神经丝丝染色色照片片显示示不同同程度度定向向排列列的PLLA纳纳米纤纤维对对神经节节形状状和神神经突突长度度的影响响。A-C纳米米纤维维定向向程度度逐渐渐升高高。Effectsoffiberalignmentonneuritelengthandgangliashape.DRGgrownfor3daysandthenstainedforneurofilamentareshownonrandomlyalignedfibers(A),intermediatefibers(B),andhighlyalignedfibers(C).CoreyJMetal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2007：：636-645目前认为用用于防止手手术后粘连连的材料是是很有限的的，而电纺纺生物相容容性的纳米米纤维是非非常有效的的。PLGA纤维膜膜可有效减减少术后伤伤害部位的的粘连，这这种优势体体现在成分分的可调性性，药物（（抗生素））导入性以以及非常容容易放置。。外科手术poly(lactide-co-glycolide)静电纺丝对对生物活性性物质影响响不大在静电纺丝丝过程中包包埋细菌和和病毒，其其均保持生生物活性,为包埋DNA，细细胞等提供供了一种有有效的方法法。组织工程支支架材料展展望人工细胞外外基质2.新一代组织织工程材料料生物材料表表面三维化化、细胞黏黏附介导生生物材料3.人工细胞外外基质智能能化温度敏感性性二维细胞胞片层转载载系统、温温度敏感性性可注射水水凝胶、释释放载体智智能化Extracellularmatrix(ECM)

Scanningelectronmicrographofnativeextracellularmatrixinconnectivetissue.Itislargelycomposedofcollagenfibrils.Thehydrogel,composedofproteoglycansandglycosaminoglycans,thatnormallyfillstheintersticesofthisfibrousnetworkhasbeenremovedbytheprocessingtreatment.人工细胞外外基质天然ECMs在组织织和器官中中起骨架作用，使细胞聚聚集，构筑筑组织，控控制组织结结构，调控控细胞表型型。ECMs主要由由胶原、蛋蛋白聚糖和和糖胺聚糖糖组成，胶原纤维提提供拉伸强强度，糖胺胺聚糖凝胶胶使营养物物、代谢物物和生长因因子扩散，，纤连蛋白白等介导细细胞的黏附附。Schematicdiagramofcelladhesiontoextracellularmatrix(ECM)moleculescontainingaspecificcell-adhesionsequence[Arg––Gly––Asp(RGD)].CellsbindtotheECMthroughintegrincellsurfacereceptors,whichconsistoftwosubunits.MechanicalforcesintheECMaretransducedintothecellviaintegrin-mediatedcellbinding.Theintegrin-mediatedcell-bindingandmechanicalforcesinfluencegeneexpressionviaeithercytoskeletonorchemical-signalpathways(e.g.tyrosinephosphorylation).KimBS,TrendsinBiotechnology,1998,16:224新一代组织织工程材料料生物材料表表面三维化化利用材料的的表面拓扑扑结构调控控细胞的行行为。研究究表明，多多种细胞可可响应微米米尺度和纳纳米尺度的的信号。成成纤维细胞胞对生物材材料表面的的三维岛状状拓扑结构构比较敏感感。成骨细细胞的细胞胞表型和骨骨接触程度度响应表面面拓扑结构构，如骨首首先在沟纹纹和裂缝内内形成。粗粗糙的表面面增强细胞胞的响应性性。利用疏水性性聚苯乙烯烯（PS））和亲水性性聚4－溴溴苯乙烯（（PBrS)在硅芯芯片旋涂过过程中的自自发相分离离原理，在在硅芯片表表面构筑三三维拓扑结结构。通过过聚合物的的共混比率率可改变拓拓扑结构的的形状，聚聚合物浓度度可调控拓拓扑结构的的尺寸。可可形成高度度(13-95nm)和横向向尺寸(0.3-2.5μm)可可调的PS岛状状结构。。13nm35nm95nmM.J.Dalbyetal./Biomaterials23(2002)2945–2954高度为13nm的岛状状结构增增强成纤纤维细胞胞和内皮皮细胞的的功能，，而高度度为95nm的的岛使细细胞的功功能有所所减弱。。FluorescentimagesofHGTFNcytoskeletonsoncontrolandtestmaterials.M.J.Dalbyetal./Biomaterials23(2002)2945–2954细胞黏附附介导生生物材料料纤连蛋白白和其他他细胞外外基质糖糖蛋白中中的黏附附结构域域中含有有特殊氨氨基酸序序列，如如精氨酸酸－甘氨氨酸－天天冬氨酸酸（RGD）。。用RGD修饰饰合成材材料表面面可介导导细胞的的黏附。。成纤维细细胞与材材料表面面接触时时首先要要黏附，，进而铺铺展,其其后才能能进行分分裂。就细胞黏黏附而言言，适宜的黏附力才才能保证证细胞的的正常迁迁移。KimBS,TrendsinBiotechnology,1998,16:22428nm58nm73nm85nm58nm,withoutRGDSchemeofbiofunctionalizednanopatterntocontrolintegrinclusteringincellmembranes:Audotsarefunctionalizedbyc(RGDfK)-thiolsandareasbetweencell-adhesiveAudotsarepassivatedbyPEGagainstcelladhesion.Therefore,celladhesionismediatedentirelyviac(RGDfK)coveredAunanodots.AseparationofAu/RGDdotsby73nmcauseslimitedcellattachmentandspreadingandactinstressfiberformation,becauseofrestrictedintegrinclustering.Thisisindicatedbynofocaladhesionactivation(FA),whereasdistancesbetweendotsof58nmcausedfocaladhesionactivation(FA).RGD的密密度要适宜宜,才能使使细胞既能能黏附又能能迁移,RGD纳纳米团簇结结构比无规规的RGD更有效地地诱导细胞胞的黏附与与迁移.对表面氨基基化后的基基底进一步步修饰使之之连接上氧氧化后的葡葡聚糖。葡葡聚糖上的的羟基通过过过碘酸盐盐反应氧化化生成醛基基，进而共共价结合上上生物活性性肽段：利利于细胞吸吸附的GRGDSP，控制细细胞的非特特异性吸附附的GRADSP，，和促进神神经元生长长活性的IKVAV。StephenP.Massia,etal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,2004,68:1(p177-186)实验中采用用的细胞为为3T3纤维维细胞，类类神经元细细胞PC12和类神神经胶质细细胞T98-G.连接有有Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro（（RAD））短肽这样样一个非促促黏附的基基团的表面面和单纯连连接葡聚糖糖的表面都都不促进细细胞黏附；；连接有Gly-Arg-Asp-Ala-Ser-Pro(RGD)短肽的材材料表面能能够显著增增强纤维细细胞和神经经胶质细胞胞的黏附,但神经细细胞（PC12）仅仅发生很小小量的黏附附；相反，，修饰有Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV)短肽的的材料表面面则能显著著提高神经经细胞的黏黏附性,而而纤维细胞胞和神经胶胶质细胞的的黏附则不不明显.修修饰有IKVAV的材料对对神经细胞胞的轴突生生长有显著著影响。StephenP.Massia,etal.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,2004,68:1(p177-186)A.含有有IKVAV的短肽两性性分子自组组装形成纤纤维状结构构。除了有有促轴突生生长的IKVAV片段外，该该分子其他他部分包括括4个Ala和3个个Gly残残基以及十十六烷烃链链，它们构构成了该分分子的疏水水部分。该该分子在水水溶液中自自组装将功功能性的基基团暴露在在外。B为为自组装后后纳米纤维维的扫描电电镜图片。。这种纳米米级纤维有有较高的纵纵横比和表表面积，可可以提供和和细胞外基基质类似的的三维环境境。GabrielA.Silva,etal，SCIENCE，303:1352-1355,2004A、B为同同一区域不不同聚焦的的在IKVAV纳米米级纤维上上培养一天天后生长的的神经元细细胞，绿色色部分为分分化成熟的的神经元细细胞，桔色色部分为星星型胶质细细胞。C为为7天后在在IKVAV纳米纤纤维上长出出的大量的的轴突。D、E为1天和7天天后在基底底上修饰层层联蛋白后后细胞生长长的结果。。可见神经经元细胞未未实现特异异的定向分分化，仍有有相当数量量的分化为为星型胶质质细胞。由由自组装形形成的IKVAV纳纳米纤维和和单层层联联蛋白相比比，大大增增加了其中中生物活性性决定基的的数量，从从而能够有有效地促进进神经元细细胞的分化化。GabrielA.Silva,etal，SCIENCE，303:1352-1355,2004人工细胞胞外基质质智能化化温度敏感感性细胞胞培养基基质以非酶解解方式回回收细胞胞片层：：poly(N-isopropylacrylamide)(PIPAAm)：：聚异丙丙基丙烯烯酰胺低临界溶溶解温