2023届 二轮复习 高考命题热点十 　荧光定量PCR技术 学案

[高考命题热点十]荧光定量PCR技术与PCR技术相关的生物学科素养主要体现角度：1．生命观念主要体现(1)物质与能量观：PCR扩增目的基因需要模板、原料并消耗能量。(2)结构与功能观：PCR仪、微量移液管、微量离心管等的使用以及注意事项。2．科学思维主要体现(1)归纳与概括：比较PCR技术和DNA体内复制的异同。(2)分析与推理：PCR技术中引物的选取。3．科学探究主要体现(1)实验操作能力：探究DNA片段的扩增及电泳实验中PCR反应体系的配方的配制以及实验流程中的动手操作能力。(2)实验现象的观察、分析能力：对DNA片段的扩增及电泳实验结果的观察、分析。4．社会责任主要体现PCR扩增的用途包括获取目的基因、对感染疾病(核酸检测)的诊断等。(经典考题)面对新冠疫情，我国一直坚持严格防控措施，“零容忍”彰显人民立场制度优势。坚持中高风险地区的大面积核酸检测、适龄人群接种疫苗构建免疫屏障是严格防控的主要措施。新冠病毒核酸检测常采用RT－PCR检测法，技术流程如下图，①②③④⑤表示相关步骤。(1)步骤①④需要的酶分别是____________________，若利用PCR技术扩增目的基因的过程中消耗了126个引物分子，则该过程DNA扩增了________次。(2)步骤③的目的是____________________________，如果该步骤出现失误，对检测结果的影响是____________________________。(3)图中的基因探针5′末端连接荧光基团(R)，3′末端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到。在定量PCR扩增过程中，当扩增DNA遇到探针时，探针就会被水解而释放出游离的R和Q，随PCR扩增次数的增加，荧光信号________(填“逐渐增强”“逐渐减弱”或“不变”)。(4)新型冠状病毒抗体检测可作为核酸检测的补充，抗体检测的原理是________。对某人进行检测时发现，其核酸检测为阴性，抗体检测呈阳性，原因可能是________________________________________________________________________。(5)预防新冠肺炎的有效措施是接种新型冠状病毒灭活疫苗，灭活的含义是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)若利用PCR技术扩增目的基因的过程中消耗了126个引物分子，且引物分子参与到子代DNA分子中，同时还有2个亲代DNA分子单链也参与到子代DNA分子中，这样子代DNA单链共有126＋2＝128，由于DNA分子有两条链，则子代DNA分子总数为128÷2＝64＝26，则该过程DNA扩增了6次。(2)步骤③是低温复性的过程，其目的是使引物A、引物B、基因探针与病毒cDNA的目的片段相结合，如果该步骤出现失误，将导致不能降解探针，进而致使存在病毒cDNA，但无法用仪器检测到荧光。(3)图中的基因探针5′末端连接荧光基团(R)，3′末端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号Q吸收而不发荧光。当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到。在定量PCR扩增过程中，当扩增DNA遇到探针时，探针就会被水解而释放出游离的R和Q，随PCR扩增次数的增加，水解的探针越多，则荧光信号逐渐增强。(4)新冠病毒抗体检测可作为核酸检测的补充，抗体检测利用了抗原和抗体发生特异性结合的原理实现的。对某人进行检测时发现，其核酸检测为阴性，抗体检测呈阳性，说明此人体内没有病毒，但检测到了抗体，则说明此人曾感染新型冠状病毒并已康复(或此人已注射新冠疫苗)。(5)预防新冠肺炎的有效措施是接种新型冠状病毒灭活疫苗，灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构，因而灭活的病毒能起到疫苗的作用，即引起机体的特异性免疫反应，产生抗体和记忆细胞，但对机体没有侵染能力，从而提高人体的免疫力。答案：(1)逆转录酶、热稳定DNA聚合酶6(2)使引物A、引物B、基因探针与病毒cDNA的目的的片段结合不能降解探针，导致存在病毒cDNA但无法用仪器检测到荧光(3)逐渐增强(4)抗原抗体特异性结合此人曾感染新型冠状病毒并已康复(或此人已注射新冠疫苗)(5)用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构1．(2022·广州模拟预测)目前我国新型冠状病毒核酸检测的方法是RTPCR，下图为RTPCR(逆转录荧光PCR技术)的原理：PCR过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和淬灭基团(抑制荧光发出)，当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光(荧光强度与探针水解量成正相关)。请回答下列问题：(1)PCR技术与DNA体内复制过程相比，两者的复制方式都是______________。RTPCR过程中，需先以RNA为模板合成cDNA，故装置中需添加________酶。除了加酶，解开cDNA双螺旋的方法还有________。(2)对新型冠状病毒进行检测时，探针是一段与______________________相同的核苷酸序列。(3)通过荧光检测到荧光信号，则可判定该检测样本为______________性(选填“阳”“阴”)，在相同PCR循环次数条件下，荧光强度与病毒数量呈____________。(4)为了在没有条件进行核酸检测前及早发现新型冠状病毒，我国于2022年3月11日推出新型冠状病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是________________________。试剂盒中的探针应采用______________技术生产。解析：(1)由分析可知，PCR技术与DNA体内复制的复制方式都是半保留复制。RTPCR过程为逆转录过程，需向装置中添加逆转录酶，以RNA为模板合成cDNA。DNA体内复制中解开DNA双螺旋的是利用解旋酶，在PCR中则是利用加热解开双螺旋。(2)由图可知，利用探针对新型冠状病毒进行检测的原理是碱基互补配对和DNA复制，当存在病毒时，以病毒的遗传物质RNA逆转录合成cDNA，探针能与该cDNA通过碱基互补配对结合，当cDNA进行复制时，会水解探针，因此探针是一段与目的基因(病毒的基因)中特定核苷酸序列相同的核苷酸序列。(3)若检测到荧光信号，说明探针与被检测物结合后被水解，则可判定该检测样本为阳性，在相同PCR循环次数条件下，病毒数量越多，复制时水解的探针越多，则荧光强度越强，即荧光强度与病毒数量呈正相关。(4)分析题意可知，新型冠状病毒抗原检测试剂盒的原理是抗原与抗体的特异性结合。与传统方法生产的抗体相比，单克隆抗体具有纯度高、特异性强的特点，因此试剂盒中的探针应采用单克隆抗体技术生产。答案：(1)半保留复制逆转录酶加热(2)目的基因中特定的核苷酸序列(3)阳正相关(4)抗原—抗体的特异性结合单克隆抗体2．(2022·辽宁模拟预测)“实时荧光定量RTPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针(如图1)，其5′端连接荧光基团(R)，3′端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当TaqDNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答：(1)结合图1和图2分析，“荧光RTPCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________酶、______酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的________、________有关。(2)根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据__________________。新型冠状病毒(2019nCoV)是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出2019nCoV特有序列，以避免________(填“假阴性”或“假阳性”)的出现。(3)根据图1和图2，TaqDNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能__________________________。(4)IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体。IgM/IgG检测试剂盒的原理是____________________，通过检测人体内相应抗体间接证明是否感染。被病毒感染后，机体会产生一系列的变化来抵御这种入侵，其中IgM和IgG的含量会发生如图所示变化。通过对COVID19患者研究发现，病毒侵入人体后，大约需要5～7天产生IgM抗体，IgG抗体在感染后10～15天时产生。通过检测外周血中IgM和IgG，不仅可以鉴别是否感染，还可以辨别检测者是近期感染或者是既往感染。当核酸检测结果为阳性，IgM(＋)IgG(－)时，可判断检测者为________________________________________________________________________________________________________________________________________________；核酸检测结果为阴性，已治愈的患者检测结果应为________________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)分析题图：图1和图2所示新冠检测基本原理是：将新型冠状病毒RNA逆转录为DNA，通过采用多重荧光RTPCR技术进行鉴定，因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有：逆(反)转录酶、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2＋、缓冲剂系等；由图2可知，引物、TaqMan探针能与模板链结合，故试剂盒中的引物和TaqMan探针决定了这种分子层面的荧光RT－PCR检测具有特异性和高灵敏性。(2)探针是依据新型冠状病毒RNA内部的一段序列(新型冠状病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)设计的；新型冠状病毒(nCoV－2019)碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出nCoV2019特有序列，以避免将流感病毒等误判为新型冠状病毒而出现假阳性。(3)根据图1和图2可知，Taq酶除了能催化DNA子链的延伸，还能催化RNA(TaqMan探针)的水解，TaqMan探针水解释放出游离R供仪器检测到。(4)新型冠状病毒基因编码多个结构蛋白，这些蛋白包括多个抗原位点，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗体检测抗原的存在，从而直接证明样本中含有新型冠状病毒，间接证明机体感染与否；题干中描述病毒侵入人体后，大约需要5～7天产生IgM抗体，IgM(＋)说明感染过病毒，IgG抗体在感染后10～15天时产生，IgG(－)说明10～15天没有抗体，检测者体为早期感染；核酸检测结果为阴性，已治愈的患者，也就是感染过，体内病毒已被清除，所以应为IgM(－)IgG(＋)。答案：(1)逆(反)转录Taq引物TaqMan探针(2)新型冠状病毒RNA内部的一段序列(新型冠状病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)假阳性(3)催化RNA(TaqMan探针)的水解(4)抗原抗体特异性结合近期感染核酸检测结果为阴性，IgM(－)IgG(＋)3．(2022·陕西宝鸡二模)近几年新冠肺炎疫情不仅对人类的健康和生命安全造成威胁，还严重影响了人们正常的生产生活。新型冠状病毒(RNA病毒)检测主要有“核酸检测”“抗原检测”和“抗体检测”3种。请回答下列问题：(1)研究人员研发了核酸检测试剂盒，通过PCR技术可对采集到的核酸序列进行扩增。新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒的检测原理是：若送检样本中存在病毒，则以病毒RNA为模板，在________酶的作用下合成cDNA，反应体系中加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP的作用是为扩增提供____________________，再加入互补的荧光探针、__________酶和____________后，cDNA开始扩增，当子链延伸至探针处，会水解探针释放出荧光基团产生荧光，荧光监测系统接收到荧光信号从而确诊。(2)2022年3月15日国家卫健委发布了《新型冠状病毒诊疗方案试行第九版》将解除隔离及出院标准的CT值从40降到至35。CT40就是把病毒的核酸循环复制40次可检测到病毒存在，即为阳性。CT值从40降到至35，说明定义阳性的标准在____________(降低、提高)(3)抗原检测是检测唾液、鼻腔黏膜或咽喉黏膜中是否存在新型冠状病毒特有的____________(分子组成)的检查。(4)我国采用新型冠状病毒化学发光检测试剂盒进行抗体检测，研究人员利用生产单克隆抗体的技术，生产出能与新型冠状病毒结合的特异性抗体。在单克隆抗体制备过程中，当杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养时，应定期更换培养液，目的是______________________。该试剂盒能快速准确地检测出病例是利用了单克隆抗体的____________________等优点。解析：(1)以RNA为模板合成cDNA的过程称为逆转录，需要逆转录酶的参与。反应体系中加入的dATP、dTTP、dCTP、dGTP，能够水解产生四种游离的脱氧核苷酸，同时释放出能量，为扩增提供原料和能量。PCR的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、2种引物、Taq酶(耐高温的DNA聚合酶、热稳定DNA聚合酶)，因此再在PCR扩增仪中加入互补的荧光探针、2种引物和Taq酶(耐高温的DNA聚合酶、热稳定DNA聚合酶)后，开始扩增cDNA。(2)根据题中有关CT40的定义可知，将解除隔离及出院标准的CT值从40降到至35，说明定义阳性的标准在降低。(3)新型冠状病毒由RNA和蛋白质组成，其蛋白质作为新型冠状病毒的抗原，因此抗原检测是检测唾液、鼻腔黏膜或咽喉黏膜中是否存在新型冠状病毒特有的蛋白质的检查。(4)杂交瘤细胞(动物细胞)在体外条件下扩大规模培养时，为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换培养液。与传统抗体相比，单克隆抗体的优点有特异性强、灵敏度高、可大量制备，该试剂盒能快速准确地检测出病例是利用了单克隆抗体的特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点。答案：(1)逆转录反应所需的原料和能量Taq(耐高温的DNA聚合酶、热稳定DNA聚合酶)引物(2)降低(3)蛋白质(4)为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害特异性强、灵敏度高、可大量制备4．(2022·江苏模拟预测)引起新冠肺炎的新型冠状病毒是一种带包膜的RNA病毒，包膜表面有与人体细胞膜表面的ACE2受体结合的S蛋白。疫苗接种和病毒检测是当前新冠肺炎疫情防控工作的重要举措。请回答下列问题：Ⅰ.疫苗的研发和接种(1)灭活疫苗。工业生产上利用Vero细胞能无限增殖特性培养新型冠状病毒，可实现________________________________________________________________________________________________________________________________________________的目的。(2)腺病毒载体疫苗。该疫苗主要成分是活的、有复制缺陷、能表达S蛋白的重组人5型腺病毒。这种方式生产的疫苗由于重组腺病毒________________________，从而提高了疫苗的安全性。(3)重组亚单位疫苗。其技术线路是：提取新型冠状病毒RNA→通过RT酶PCR(反转录酶聚合酶链式反应)技术扩增筛选RBD蛋白(S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分)基因→构建基因表达载体→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入________________酶；扩增RBD蛋白基因时，应选择的引物为__________________。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准(Marker)，2号泳道是以________________________为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。图3中3号泳道出现杂带，原因一般有________________________(至少答出2点)。基因表达载体构建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是________________________________________________________________________。Ⅱ.新型冠状病毒的检测(4)核酸检测图4是我国自主设计的新冠病毒核酸检测平台示意图，图5为RTPCR(实时荧光逆转录聚合酶链式反应)示意图。当探针完整时，荧光基团(R)发出的荧光信号被淬灭基团(Q)吸收而不发荧光；当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。①加入自动化PCR体系配置中的引物和探针的设计依据是________________________。引物和探针与模板结合发生在PCR循环中的________阶段。②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的值为1，若经n次的PCR扩增，实时荧光信号强度________(填“增强”“减弱”或“不变”)，说明样液中病毒的核酸数量为0；若荧光信号强度值为a(2n－1)，推测样液中病毒的核酸数量为________。(5)抗原和抗体检测为了及早发现新型冠状病毒的感染者，新型冠状病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施。这两种试剂盒的检测原理为________。对于已注射过灭活疫苗的人员，应选择________(填字母)检测。a．核酸检测b．抗原检测c．抗体检测解析：(1)vero细胞是指非洲绿猴肾细胞，可用于检查大肠杆菌毒素，作为培养病毒的细胞宿主和真核寄生虫的宿主细胞。之所以选择vero细胞生产病毒，是因为它容易培养，传播稳定，可以无限分裂，所以vero细胞用于生产许多疫苗。新冠疫苗vero细胞的原理是将培养扩增的活病毒，灭活后经过一系列纯化技术，然后制备疫苗。灭活的主要特点是免疫反应强，安全性和稳定性好，运输方便。因此工业生产上利用vero细胞能无限增殖特性培养新型冠状病毒，可实现获得大量新型冠状病毒，降低生产成本。(2)重组腺病毒载体疫苗，是利用基因工程技术，把致病病毒A的关键基因片段植入到改造后的无害病毒B里，重组成疫苗。这个疫苗和无害病毒B一样不致病，却拥有病毒A的长相，能使免疫系统认识病毒A，并产生免疫