RNA测序：进展、挑战、机遇

RNA测序：进展、挑战和机遇摘要：在大规模并行的cDNA测序或RNA测序最初应用的几年中，定性和定量转录有了许多进步。近日，几种RNA测序方法的发展对RNA转录给出了一个更完整的描述。这些进展包括在转录起始位点映射的改进，特异链的具体测定，融合基因检测，小分子RNA的特性和选择性剪接事件的检测。目前的发展在应用RNA测序方面尤其是RNA的直接测序及从少量细胞材料中进行RNA的定量分析方面做更近一步的改进。在过去的10年，我们统计鉴别了从简单模式生物到人这些物种的包含DNA修饰和RNA的定性、定量变化这些动态的基因组位点的特性。通过使用各种基因组测定包含广泛的基因组研究引起了他的发展。现在我们有了一种新的鉴别复杂转录体的方法来命名一些先前大量不知的编码和不编码的RNA种类，尤其是sRNA包含microRNAs,与启动子相关的RNAs和新发现的反义与3'端相关的RNA。最初的转录研究大量依赖于以芯片技术为基础并为全目录提供有限能力和定量不同的RNA分子的杂交，在表达上超过了一个很宽的水平。高通量的下一代DNA测序技术（NGS）的介绍使通过cDNA的大量测序进行RNA的分析的转录组学发生了变革。这种发展除去了由包含检测有限动态范围在内的芯片技术的许多挑战。为RNA测序所建立的NGS平台在商业上被4个公司购买——Illumina,Roche454,HelicosBioSciencesandLifeTechnologies，一些新的技术则被其他公司所发展。RNA测序像基因组研究一样，NGS公司打算以最低的成本不断地提高测序性能这个平台，给出一些像侧通量、阅读长度、错误率、完成成对碱基阅读的能力等这些重要的测序性能。一些研究RNA测序的新方法提供了越来越多的更全的有关真核和原核生物在定性和定量方面转录生物学的信息。在这我们讨论关于更广泛理解转录起始位点方法、正义和反义转录目录、提高选择性剪接的检测、基因融合转录的检测的进展，这些在癌症研究上变得越来越重要，它所占的比率在几年之前是无法想象的。近期方法的发展也允许之前选择特殊的RNA分子进行RNA测序，允许转录组学有更多的聚焦目标。在本文中，我们提供了一些方法的概述，接触所允许的生物洞察力的类型并集中在他们自己的技术上。我们提供了不同方法间的比较，为了能够提供各种应用并讨论现今的一些缺陷和未来发展的潜能。通过讨论两种新的RNA测序技术直接RNA测序（DRS）和可靠的分钟RNA测序方法，我们推断：他们在横向研究和RNA测序的临床应用方面起着重要的作用。转录起始位点图谱在核苷酸分辨率上的转录起始位点图谱（TSSs）对定义RNA的产物和辨认邻近的调节转录表达的启动子方面是必须的。第一个高通量的TSS图谱方法是帽的基因表达分析（CAGE）方法，他是由最初的Sanger测序发展来的，这是与从带有完整5‘末端的RNA克隆cDNA产物有关的测序。尽管有用，但这个技术需要输入大量的RNA并且每个TSS只产生很短（20个核苷酸）的阅读。这种限制引起了NGS平台的CAGE方法的调节，结果发现了TSS在基因组周围分布的复杂性及周围独特的启动子。与CAGE结合在一起的RNA测序技术包括深度CAGE、PEAT、nanoCAGEandCAGEscan，这些共同解决了以CAGE策略为基础的Sanger测序的许多技术挑战。首先，通过使用放大技术nanoCAGE现在能从10ng的总RNA量做出TSS图。其次，PEAT的兼容性和双末端测序的CAGEscan允许检测TSSs下游区的连通性并促进TSSs识别特殊的转录。此外，双末端测序部分缓和了校正重复区单个短小的阅读的难度，并允许重复部分的子集在RNA测序时至少有局部的特性。然而，以NGS为基础的方法有许多说明。其中之一就是没有目的的检测一些扩增和其他的操作步骤是否使用，这些已实施的操作步骤歪曲了对每个TSS出现频率的管抽查结果。实验中的Spike可能对处理这些问题是有用。此外，在cDNA合成和扩增协议发展之中遇到了多重困难。例如研究者观察人为制品如引物二聚体,这就控制了测序的数据并减少有效的覆盖，促进SemisuppressivePCR的使用来减少引物二聚体的频率。因此，尽管这些方法在定性方面是有用，但提高和建立他们在定量方面的能力可能需要其他的发展。常规的以RNA为基础的依赖于cDNA合成或杂交的TSS图谱方法有一些局限性，这种方法的效率局限于RNA的序列和结构。此外，以RNA为基础的TSS图谱对于像microRNA这种被描述为在高水平上一般的但又自身缺乏迅速降解能力的短暂的转录是一个挑战。这些限制部分再结合其他方法限制会被缓和，，如以染色质为基础的TSS预测，他是依赖于组蛋白修饰的有效转录的检测。近来一些在后转录加工出现的像5'帽子结构的RNA片段的建议对整合是有用的。因此，单独依赖于CAGE数据的TSS图谱可能会引起转录起始事件从RNA加工事件中分离出去的难题。特异链的RNA测序一系列物种转录组的研究显示了反义转录事件的普遍存在。尽管这些事件曾经被考虑用来体现生物技术，但现在反义转录的功能是清楚的，并在正常的生理状态和疾病状态下起各种作用。因此有一个关于转录组属性的更深的描述正义链和反义链转录产物的发展。标准的RNA测序方法一般需要双链cDNA的合成来消除RNA链的信息。此外，在合成cDNA第一条链期间，依靠依赖DNA进行转录的DNA聚合酶（DDDP）这种反转录酶的活性产生了人工制造的cDNA的第二条链。这能混淆转录检测的分辨率。放线菌素D作为抑制反转录酶DDDP活性的物质，它的抑制程度会受影响但并没被完全检测出。为克服这些难题，发展了一些转录链特异性的分析策略。这些策略形成了依赖3个方法之一的特异链的信息。第一个方法包含了RNA尾部或cDNA分子第一条链预定方向上的连接器的结扎，已知方向上的连接器被作为获取RNA链信息的参考点。第二个方法是直接对cDNA的第一条链进行测序。最后第三种方法是在cDNA合成的第二条链产物或RNA上选择化学标记。这些策略已经为我们了解转录，包括RNAs转录位点图谱和识别RNAs相关的启动子方面开始做出贡献。近期使用酿酒酵母的基因组作为这些策略间进行性能比较的一个参考进行了研究，研究者发现了这些关于链的特异性的水平、平均覆盖率、库的复杂性等方法之间的不同之处。然而更深的有关各种方法人工制品和偏差的特异性的对比研究是缺失的，所以对这些数据进行处理的科学家应该意识到这些问题。首先，给出了逆转录酶在合成cDNA的第一链期间形成第二链产物的倾向，搞不清楚的是这个依赖于cDNA第一链产物测序的方法是否完全有链的特异性。这些方法通过链的特异性定量阅读比率报道了已知反义链的方向，好的有附注的基因、与有义链方向图谱相关的阅读。调查显示一小部分的阅读是为了定位反义方向；所以这些链可能不完全是特异性的链。此外，cDNA产物包含第一、第二两条链，不能恰当对参考序列进行定位。对基因组正义和反义的转录给出了不完全的注释，甚至在像酿酒酵母这样较好的研究物种中，也要小心的评价这些方法的链特异性的真实程度。理论上，应履行以定义化学合成RNA序列所进行的评估。2.结扎倾向于有序列的偏好。依赖于结扎的这一方法需要忍受不同表现性的偏差。在转录组属性和核糖体属性试验中发现了偏好的例子，看到了与准备使用3‘端多聚腺嘌吟酶的库相比使用结扎的库不均匀的覆盖率。3.,内部解决或表面扩大步骤包含许多额外的附加品介绍方法，例如，以GC形式和复制体的阅读。检查这些影响显示复制体阅读部分的标准范围为6.1%--94.1%和特异链RNA测序策略的启迪。RNA模板对GC的存在有一定的偏见，所以拥有中度的GC含量。期望许多局限能通过测序技术的发展或已有测序技术的改变和提高得到解决。选择性剪接模式的特征给出选择性剪接模式发展的重要性和已知15%-60%引起突变影响剪接的疾病，他是完整剪接事件的关键目录和理解如何选择对细胞分化和人类疾病发展有益的剪接模式。最初使用RNA测序方法进行剪接位点图谱的研究受到阅读长度的限制，阻止了可靠的2个独立部分编码顺序基因组的定位。因此，最初的RNA测序交替剪接的研究使用了计算机来弥补这一限制。用于定位的参考序列是基因外显子间所有可能剪接点的人工序列。这些方法改变了我们有关人为剪接的观点，如在超过95%人为外显子基因内发现了每个110000个新型剪接位点的选择性结合。通过计算每个外显子阅读图谱的数量和每个剪接点的生成，决定每个接点剪接效率和不同亚型量化的水平。改进现今的测序技术能增加阅读的长度，更好的阅读图谱来结合外显子。这些提高来源于阅读区的分块，来定位基因组各自的区块。此外，发展双末端阅读方法能从转录的预计阅读间距离两点上获得测序信息。现在在不需要先前转录信息的基础上能检测剪接模式。检测剪接模式和转录连通性和基因组方式需要获得全长转录序列，这些在未来可能产生新兴技术。基因融合检测与计算机分析相结合的RNA测序类似于上面所描述的结合位点的检测，他也能用来识别有病组织中的基因融合现象，尤其是在对癌症的研究特别重要。利用单个阅读和双末端阅读策略检测易位和基因组重排从而分析基因组DNA。然而，RNA测序通过识别产生异常的RNA物种能变得更好，因此有一种更高的功能或生物成因或疾病设置的可能性。此外，基因组DNA方法不能识别由于非基因组因子，如转移剪接、临近转录物间通读所引起的融合现象。双末端RNA测序对融合的识别有特别的优势，因为他提供物质上增长的覆盖率。这种方法致使肿瘤学上重要的发现，并为调整治疗提供潜在的可能性。对融合检测这些挑战通常是平行比较这些选择性剪接检测。此外，RNA测序分析不能检测包括拥有编码序列的其他基因的启动子融合现象。此外，RNA包含嵌合的cDNA人工制品的测序数据在逆转录和扩增期间产生模板开关。在基因融合识别中可能导致假阳性出现，当有足够的通量和测序性能的RNA长阅读测序技术变得有效时，这些不同可能会部分得到缓和。RNA定向测序方法尽管依靠生产量和成本的降低使NGC能力得到了发展，支出为获得足够的序列覆盖率是必须的，临床应用的潜能是被禁止的。应用程序包括低风度转录的描述和基因型的测定，例如，转录的等位基因在表达上是不同的。在这些情景，转录部分越丰富越好，测序的总成本达到最少，样品数达到最多。丰富的目标策略起初是基因组DNA重新排序所发展起来的。许多技术用来捕获基因组DNA的外显子，给出引起疾病的大部分的突变来分离编码蛋白的转录组。含polyA的RNA物种测序提供了一种在不适用丰富策略的条件下对外显子测序的自然途径。适合mRNA测序的数据用来识别核苷酸的变化的潜能近来在一些研究中得到了证实。然而，这些研究也强调了很多挑战-例如高序列深度需要充分的覆盖低丰度的转录。少量的cDNA应用的基因组DNA的修饰允许目标RNA测序方法的发展。定向RNA测序方法被用于检测融合转录，特异等位基因的表达，突变和用于转录的RNA的编辑。定向RNA测序策略与其他方法相比，现今由于额外的探针或微阵列的准备和目标选择这些步骤需要较长的样品准备步骤和高的RNA和cDNA输入量。此外，捕获效率通常因依赖杂交效率的目标区和其他因子有所不同。过程的简化和捕获效率的提高是为了得到更好的实验结果。小RNA性能的分析NGS技术在sRNA的发现和特性描述上的影响是特别显著的。这些研究被其他人广泛评论，所以我们不用深入讨论这一主题，只需给出完整的简单概要。使用焦磷酸测序初期的sRNA，后来其他高通量NGS平台的使用引起了基因组的调查和数目增长的sRNA的发现。因为NGS样品的准备策略是长的RNA（＞200核苷酸），对sRNA是不合适的，如随机引物逆转录，发展了修饰准备策略。现今研究sRNA的RNA测序方法的一个重要限制是他们没有能力提供一个转录绝对量的观念。他近来变得清晰，尽管以NGS为基础的sRNA剪接方法对不同的表达分析是有用的，获得每个sRNA的阅读数量不是找出他实际丰度所必须的。这一差异看起来是由于在样品准备和测序期间的偏差引起的。新兴技术能否提高sRNA定量测定让人拭目以待。直接RNA测序cDNA的合成和其他RNA操作限制了一些RNA测序方法的应用。上文提到的，许多现今的RNA方法依赖于cDNA的合成和后来的操作步骤，这替代了一些应用方法的局限。例如，我们所讨论的产生人工的cDNA的第二链对特异链RNA测序是困难的。特异链库准备禁止这一问题，但是方法是使用RNA-RNA连接和建设。cDNA合成的其他限制是模板开关。在反转录期间，合成的初期的cDNA有时会从RNA中分离出来，再退火至RNA序列特异性对初始模板的延伸，产生人工嵌合的cDNA。模板开关能在外显子-内含子界限的识别和嵌合转录上产生问题。反转录也能利用独立的引物合成cDNA,这一反应被认为是由于RNA第二结构产生的自动吸引。这引起了cDNA自由合成的产生。此外，反转录酶与其他酶相比有低的保真度，这源于他们缺乏校正机制。从RNA至cDNA转化的转化效率受实验条件的影响。除他们需要cDNA合成外，现今的RNA测序方法遇到了其他难题。首先,RNA测序信号通过转录变得不均匀覆盖，这就可能在不同步中如随机引物设置、cDNA合成、连接、扩增、测序，引起偏差。第二，统一使用RNA测序策略由于多重破碎和RNA或cDNA尺寸选择步骤引起了转录长度的偏差。这一偏差导致了下游分析的合并。第三，RNA测序的定量转录需要考虑（由于测序错误率、重复单兀、不完整基因组序列和转录精确）不确定的阅读图谱和每个转录阅读图谱的正常化。尽管转录方法的提高和生物信息学的发展允许转录组从头合成的结构，存在的方法通常不足以检测确定的转录或覆盖他们全部的长度。与有关转录不确定的界限和长度，因为像选择性剪接多聚A位点和启动子的使用，正常化长度的需要是对对定量扩增的一个潜在的错误源。第四，RNA测序策略包含丰富的多聚AmRNA.转录的多聚A通常在转录降解步发生，因此丰富的polyA利用RNA转录聚合酶I丰富了RNA降解产物和各种RNA。直接RNA测序。现今RNA测序方法的局限至少通过RNA分析技术，包括本质上改变了RNA特性描述DRS方法部分得到了缓和。DRS如今需要对单个分子的功能进行测序，如在不需cDNA转换下直接扩增RNA分子。尽管依赖于RNA的RNA聚合酶是存在的，然而他们适应扩增的下一代测序技术目前是未知的。第一个巨大并行的DRS方法是利用Heticos单分子测序平台发展起来的。他依赖于几种RNA模板3'端多聚A与单个通道多聚dT序列相杂交合成序列。这一方法能从总RNA或细胞裂解物中选择polyA。测序数据来源于上游的polyA位点区。因此，策略提供了一方法来获得基因表达文件和帽子多聚A位点。缺乏天然polyA尾巴的RNA物种能在体外利用DRS合成polyA。DRS方法的发展对象模板开关和合成第二链这些cDNA合成的人造品是自由的。提供潜在的应用如测量特异链的转录的提高。此外，依靠应用和涉及相对单一样品的DRS只需要输入飞克或attomole水平的RNA。DRS型技术可能应用的优势是挑战了以cDNA为基础的方法，如生产亚微克水平的RNA，样本档案或少量的RNA物种不能轻易转换成cDNA。与需要不同策略来分析短、长RNA物种的cDNA方法不同，DRS样本的准备涉及到多聚腺苷酸在RNA物种上的应用，允许短或长的RNA在单一试验中被发现。DRS在未来也许能通过授权整合目标的选择和测序步骤中把RNA测序作为目标。这些整合在只有核酸碎片时降低样品准备步骤，通过输入必须核酸数量来把成本降至最低。对于DRS的重要的一个挑战是产生数百万水平的阅读量，通过改变化学序列和捕获模板步骤需要许多RNA应用，尤其是定量应用，并进一步减少错误率和输入RNA量。DRS也没有解决在上文提到的RNA测序的所有限制，包括如捕获polyARNA降解酶产物的问题。因此，双末端方法和DRS和长阅读的组合在上文讨论的对不同的应用是必须的。包含识别RNA物种5‘和3'端的研究。少量RNA样品的设置生物学样本（如组织和体内液体）通常是不均匀的，是多种细胞类型的复杂的混合物。尤其是在细胞特殊的选择和研究中是必须的，但实现这一工作确是不明确的。现在几种像流式细胞仪（EACS）、液晶显示模块（LCM）、系列稀释、专业流体装置和显微操作工具允许选择特殊的细胞类型。此外，从少量的细胞中分离高质量的RNA的方法是有效的。全球分钟RNA定量装置与高通量少量样品RNA方法的不相容性主要限制了可靠性。这些方法的缺失降低了在分辨率、干细胞生物学、宏基因组学、植物生物学这些区域的发展速度。在癌症和其他疾病的研究中强烈感觉到了这种局限，例如得到的病原组织通常受到量的限制；分子设置研究和用于临床和分子诊断学间的技术的转变都是被忽略的。利用大量RNA的输入进行转录的策略提供了广泛的、无偏见的观念，因此在很宽的区域有很大的发展空间。少量RNA的方法。低量RNA样品利用全球微阵列和序列技术的分析需要1个或更多的扩增步骤来获得足够的用于后续检测的核苷酸材料。从早期1990s,几种为低量RNA的应用的核苷酸扩增的策略得到了发展，如连接介导PCR,低重置扩增（MDA），单信号等温扩增和体外转录（IVT）的线性扩增。这些理想的扩增方法提供了精确的几乎无错误的可再生的序列，产生高水平扩增来提供所需定量的核苷酸，从大量物种中提取的核苷酸保护原样品中独特的RNA分子。通过测量微阵列来进行研究，来分辨扩增变异性和差异，尤其是中和低丰度的转录，更进一步降低输入RNA的量。低量RNA测序是相对较新的。近期报告的mRNA测序方法依赖于PCR扩增步骤，能用于单个卵母细胞转录属性的测定。然而，如此低量RNA测序方法的再现性可能对随机扩增的偏差有消极的影响，引起一些RNA物种的消失和其他的优先扩增。例如重复阅读和定量能力的降低导致了这些结果的出现。新兴技术。现在新型的一系列杂交和测序方法，可能允许从分钟细胞量上得到的可靠的转录组配置。在测序方面，nanoCAGE现允许TSS图谱通过不同的扩增策略总共使用10ng的RNA。扩增RNA序列的方法近期因需要输入RNA量的降低而得到了发展。一种包含至少约500pgRNA的cDNA第一链产物的序列的方法，引发实现了oligo-dT或随机引物的变化。其他的包含使用poly（dT）引物在序列表面从细胞裂解液中选择polyA的方法，允许可产生的从约100细胞中的基因表达，消除RNA隔离所引起的RNA的缺失，这对减少输入细胞数量方面尤其重要。像上面描述的，DRS消除了cDNA合成阶段，仅需要包含polyA尾部或体外RNA多聚腺苷酸的马克级的RNA分子。他也使微流体能力与单细胞DRS的应用连到一起成为一种可能。提供少量的R