血管生成素Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响,人体生理学论文

血管生成素Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响,人体生理学论文脊椎动物的血-脊髓屏障〔blood-spinalcordbarrier,BSCB〕是血脑屏障〔blood-brainbarrier,BBB〕的延伸，是中枢神经系统特有的屏障构造。BSCB由脊髓微血管内皮细胞〔spinalcordmi-crovascularendothelialcell,SCMEC〕间的严密连接及星形胶质细胞周足构成，可有效地阻止血液中的大分子进入脊髓本质，为中枢神经系统提供稳定的微环境[1].现有研究表示清楚，多种脊髓病变与BSCB屏障功能异常有关，如创伤性脊髓损伤[2,3]、放射性损伤[4]、肌萎缩性脊髓侧索硬化症[5,6]、感染[7]等。内皮细胞间的连接蛋白及细胞骨架是构成内皮细胞屏障的主要分子基础，其表示出量、分布及互相作用的改变是导致内皮细胞通透性增高的直接原因[8].血管生成素〔angiopoietin,Ang1〕是一种有效的血管生成因子，介入血管生成的各个阶段，很多其他血管生成因子可通过Ang1诱导新血管的生成。在血脑屏障，Ang1作用于Tie-2酪氨酸激酶受体，介入维持屏障完好性及血管稳定[9,10];最近有研究报道，Ang1可通过上调严密连接蛋白ZO-2〔zonulaoccludens-2〕稳定脑微血管内皮细胞[11].在非中枢神经系统微血管内皮细胞，Ang1可通过PI3K/Akt途径发挥抗凋亡[12]及维持血管稳定性的作用[13].本研究以分离培养的大鼠SCMEC为研究对象，在体外建立BSCB模型，讨论Ang1-Akt途径对血脊髓屏障的通透性影响并初步分析其作用机制。1材料与方式方法1.1实验动物与试剂成熟Sprague-Dawley大鼠〔275~300g〕由中国医科大学实验动物部提供。DMEM/F12培养基为Sigma公司〔美国〕产品；碱性成纤维细胞生长因子〔bFGF〕、血管内皮生长因子〔VEGF〕、血管生成素1〔Ang1〕购自Peprotech公司〔美国〕；Wort-mannin购自GeneOperation〔中国〕；蛋白G琼脂糖购自Pierce公司〔美国〕；PKA抑制肽购自MerckMillipore公司〔德国〕；组蛋白H2B为EnzoLifeSciences公司〔瑞士〕产品；[-32P]ATP购自北京福瑞生物科技有限公司〔中国〕；兔IgG、兔抗大鼠occludin、ZO-1、-catenin抗体、驴抗兔IgG〔FITC〕、ProlongGoldAntifade封片剂购自Invit-rogen公司〔美国〕；山羊抗大鼠Akt1、-actin、兔抗大鼠pAkt抗体、牛抗山羊IgG〔HRP〕、牛抗兔IgG〔HRP〕购自SantaCruz公司〔美国〕；兔抗大鼠VE-cadherin购自Abcam公司〔美国〕；DC蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad公司〔美国〕；加强型化学发光试剂盒购自Pierce公司〔美国〕；其他常规试剂为Sigma公司〔美国〕产品。1.2主要仪器设备Millicell誖ERS-2细胞电阻仪；MilliporeMilli-cell插入式细胞培养皿；Beckman液闪计数仪；Bio-Rad电泳仪及电泳槽；Eppendorf台式低温离心机；苏净VS-1300U超净台；ThermoScientificSeries8000CO2细胞培养箱；OlympusBX51荧光显微镜。1.3实验方式方法1.3.1大鼠脊髓微血管内皮细胞〔SCMEC〕的分离培养。按本实验室常规方式方法分离培养大鼠SCMEC.成熟SD大鼠CO2窒息处死，手术分离椎管后注射冷D-Hanks液以分离脊髓组织，去除脑脊膜及大血管。冷DMEM/F12培养液中剪碎组织至1mm3大小，冰上匀浆后于37℃水浴胶原酶Ⅱ消化30min.消化产物200g离心5min,22%BSA重悬组织沉淀，2000g离心10min,弃上层髓磷脂成分，DMEM/F12清洗下层血管组织。无菌滤器〔BDFalcon,295m及40m〕依次过滤以进一步去除大血管及血细胞，收集微血管组分。0.1%胶原酶及脂肪酶于37℃消化脊髓微血管30min,间歇搅拌并镜下观察，待内皮细胞出芽呈串珠样时1000g离心5min终止消化。SCMEC培养液〔DMEM/F12、10%胎牛血清、10%马血清、2mmol/L谷氨酸钠、1g/L肝素、1g/LbFGF、10g/LVEGF、50mg/L庆大霉素、3mol/L嘌呤霉素〕重悬消化后的微血管组分，接种于预铺IV型胶原及纤连蛋白〔均为5g/cm2〕的培养平板，接种密度为1104/cm2.培养6d待细胞融合成单层后常规免疫荧光观察因子Ⅷ表示出情况，确定SCMEC分离培养纯度﹥95%.0.125%胰酶〔含0.02%EDTA〕消化SCMEC,按不同密度进行传代：1〕1∶1接种于6孔培养板，用于蛋白样品制备；2〕1:5接种于6孔培养板〔内预置盖玻片〕，用于细胞免疫荧光；3〕1∶1接种于Millicell插入小室，置于24孔板〔预铺胶质细胞〕中，用于跨内皮电阻〔TEER〕测定。所有培养细胞于37℃5%CO2培养箱中培养7d,每2~3d更换培养液。1.3.2血管生成素1〔Ang1〕处理培养细胞为检测Ang1对体外SCMEC屏障功能的影响，于培养第7d用Ang1〔0.1mg/L〕或Ang1〔100mg/L〕+Wortmannin〔0.1mol/L〕处理细胞12h,于不同时间点〔0、4、8、12h〕测量Ang1处理后跨内皮电阻变化，并收集SCMEC进行激酶活性测定及免疫印迹等检测。1.3.3Akt激酶活性测定通过测定Akt底物蛋白H2B的磷酸化状态反映Akt激酶活性，详细如下：收集SCMEC制备蛋白裂解液，蛋白G琼脂糖4℃预孵育30min后参加抗Akt抗体免疫沉淀2h,离心后依次用裂解液、纯水及激酶反响液〔50mmol/LHEPES、10mmol/LMnCl2、10mmol/LMgCl2、1mmol/L二硫苏糖醇、1mol/LPKA抑制剂，pH7.2〕清洗沉淀。在反响液中参加20Ci/mL[-32P]ATP及0.2g/L组蛋白H2B,30℃孵育10min.取25L反响液滴于Whatmanp81阳离子交换滤纸，5%磷酸溶液终止反响，充分清洗后放入含10mL蒸馏水的液闪瓶内，Beckman液闪计数仪测定cpm值。除此之外，本研究亦采用放射自显影检测Akt激酶活性，即在上述激酶反响液中参加50Ci/mL[-32P]ATP及组蛋白底物，30℃孵育30min后用SDS样品缓冲液终止反响，SDS分离蛋白成分后放射自显影观察H2B的磷酸化状态。1.3.4跨内皮电阻〔TEER〕测定使用Millicell誖ERS-2细胞电阻仪测量双室培养系统中SCMEC跨内皮电阻值，以反映其内皮屏障功能及通透性。在Ang1处理后不同时间点〔每个时间点设置3个平行孔〕，将正负电极分别置于培养内室及外室，记录待测孔电阻值〔Ru〕，按公式TEER=〔Ru-Rc〕S计算各组TEER值〔cm2〕，华而不实Rc为未接种细胞空白孔电阻值，S为培养面积。1.3.5免疫印迹及免疫共沉淀收集各组SCMEC,NonidetP-40裂解液〔50mmol/LTris,150mmol/LNaCl,2mmol/LEG-TA,10%glycerol,1%NonidetP-40,2mmol/LPMSF,1mmol/LNa3VO4,1g/mL亮肽素，1mg/L抑肽酶，pH7.4〕处理后提取总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。每组按30g上样量进行SDS电泳分离蛋白成分，转印至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭，依次经一抗、二抗孵育后进行ECL显色〔-actin做为内参照〕。免疫共沉淀实验中每组取400g蛋白裂解液，用2g兔IgG进行预处理，参加蛋白A琼脂糖珠离心后，取上清参加2gIP抗体〔ZO-1或VE-cadherin,另设无IP抗体IgG对照〕，室温于旋转混匀过夜，参加蛋白A琼脂糖珠沉淀抗原抗体复合物，离心后用上样缓冲液处理琼脂糖珠，煮沸变性，SDS分离蛋白后按上述方式方法进行免疫印迹分析〔抗occludin或抗-catenin抗体〕。1.3.6细胞免疫荧光4%多聚甲醛固定经Ang1处理12h后的SCMEC,0.1%Triton-100通透，5%牛血清白蛋白封闭，依次经抗ZO-1或VE-cadherin抗体及FITC标记IgG孵育后，ProlongGoldAntifade封片剂〔含DAPI〕封片，于OlympusBX51荧光显微镜下观察结果。1.3.7统计学分析本研究中TEER、免疫印迹、放射自显影等实验结果均采用GB-STAT软件〔DynamicMicrosys-tems〕进行双因素方差分析及Dunnetts检验，P0.05为差异显着，P0.01为差异非常显着，有统计学意义。2结果2.1Ang1处理加强体外培养SCMEC中Akt激酶活性。体外分离大鼠脊髓微血管内皮细胞〔SCMEC〕，建立体外血-脊髓屏障。由于在培养的内皮细胞系中Ang1可通过Akt-PI3K途径影响内皮细胞活力及血管生成经过[1],在本研究中我们首先检测了Ang1对SCMEC中Akt活性的影响。分别用Ang1、Ang1+Wortmannin〔WM,PI3K/Akt途径抑制剂〕处理传代培养第7d的SCMEC单层，预处理后0h、4h、8h、12h收集各组细胞。免疫印迹结果显示，Ang1处理4h后，Akt1磷酸化水平与对照组相比有明显升高，Wortmannin则可抑制Ang1引起的Akt1磷酸化〔图1A、C〕；以组蛋白H2B为底物，放射自显影〔图1B〕及液闪计数〔图1D〕均显示Ang1处理后，Akt活性有显着增高。该结果讲明，Ang1在本研究分离培养的SCMEC中能够活化Akt,且该作用可被Wortmannin所抑制。2.2Ang1通过影响Akt活性增强体外培养SCMEC屏障功能。为确定Ang1-Akt通路对BSCB屏障功能的影响，在Ang1处理双室培养的SCMEC后不同时间点测定跨内皮电阻〔TEER〕。结果显示，Ang1处理后4h,SCMEC单层上皮TEER值与对照组相比明显升高，即Ang1可加强体外培养SCMEC屏障功能；除此之外，该效应可被Wortmannin所拮抗，即与Ang1处理组相比，Ang1+WM组TEER值有所下降〔图2〕。该结果表示清楚，Ang1可能通过影响Akt活性加强体外培养SCMEC屏障功能。2.3Ang1-Akt通路影响连接蛋白在SCMEC细胞连接处的分布为进一步明确Ang1-Akt途径影响SCMEC屏障功能的机制，我们检测了几种细胞连接蛋白〔occludin、ZO-1、VE-cadherin、-catenin等〕经Ang1处理后在细胞连接处的分布变化。为更清楚明晰地观察细胞接触面，我们在细胞免疫荧光试验中采用1∶5比例进行传代培养，在该培养条件下，SCMEC大多〔60%〕呈现多角形。结果表示清楚，严密连接蛋白ZO-1及粘着连接蛋白VE-cadherin在Ang1处理后在细胞连接处的分布显着加强，而Ang1+WM组则无此改变〔图3〕，提示Ang1可通过Akt活性影响连接蛋白在细胞外表的分布，进而加强SCMEC的屏障功能。2.4Ang1-Akt通路影响SCMEC连接蛋白间的互相作用。在观察到Ang1对ZO-1及VE-cadherin在细胞连接处的分布影响后，我们进一步通过免疫共沉淀检测了细胞连接蛋白间的互相作用改变。在Ang1处理12h后，收集SCMEC裂解液，统计分析Co-IP结果显示，Ang1能够加强occludin/ZO-1及VE-cadherin/-catenin之间的互相作用分别达200%及150%以上，而Ang1+WM组与Ang1处理组相比则抑制了连接蛋白间的互相作用，表示清楚Ang1-Akt途径可通过促进细胞连接复合体的构成提高SCMEC的内皮屏障功能〔图4〕。3讨论脊髓微血管内皮细胞〔SCMEC〕在构成血脊髓屏障〔BSCB〕中的功能与脑微血管内皮细胞〔BMEC〕构成血脑屏障〔BBB〕中的作用类似，近年来在血中枢神经系统屏障的研究中建立了很多成功模拟BBB或BSCB的体外模型[14~16].本研究通过分离培养成熟SD大鼠脊髓微血管，在适当条件下消化培养SCMEC,经因子Ⅷ特异性抗体检测，SCMEC纯度可达95%[14,15];在这里基础上，于双室培养系统培养SCMEC和胶质细胞〔已经知道后者可诱导中枢神经系统血脑屏障的构成[17]〕，通过每日测定TEER反映内皮屏障功能，发如今该培养条件下经6~7d的培养，TEER值可达45~60cm2,表示清楚成功建立体外BSCB模型。Ang1基因位于染色体8q22,由498个氨基酸组成，主要由周细胞及血管平滑肌细胞表示出，作用于内皮特异性酪氨酸激酶受体Tie-2,其同源蛋白Ang2为其天然的竞争性拮抗剂。转基因研究证实，Ang1基因缺失或Tie-2基因敲除的小鼠胚胎血管构成障碍、通透性增高且缺乏连续性进而不能构成血管网；而Ang1过表示出的转基因动物则表现为血管增生变粗且内皮细胞与周细胞的连接完好[18].Ang1在维持血管稳定性方面发挥重要作用，有报道称华而不实牵涉Akt介导的抗凋亡效应[9,12];除此之外，Ang1可通过激活磷脂酰肌醇激酶〔PI3K〕引起柱蛋白〔paxillin〕磷酸化，加强内皮-基质间的互相作用，增加内皮管状构造的完好性。在本研究中，我们首先检测了Ang1对体外培养的脊髓微血管内皮细胞Akt激酶活性的影响，即用Ang1处理培养SCMEC后收集细胞裂解液，采用[32P]-掺入试验测定激酶活性，放射自显影及液闪计数结果均显示Ang1处理后可引起SCMEC中的Akt活性增高。结合以往报道，该结果提示Ang1对PI3K/Akt途径的调节作用在内皮细胞中是普遍存在的。在这里基础上，我们又进一步检测了Ang1对体外BSCB屏障功能的影响，TEER测定结果表示清楚Ang1处理4h后，SCMEC屏障功能显着加强，同时发现该作用可被PI3K/Akt途径特异性抑制剂Wortmannin所拮抗，讲明Ang1可通过影响Akt活性调节BSCB功能，降低其通透性，维持BSCB的稳定。在内皮屏障构造中，相邻内皮细胞间的细胞连接的构成及完好性对内皮通透性的维持至关重要。因而，我们检测了Ang1处理后几种连接蛋白〔occludin、ZO-1、ZO-2、VE-cadherin、-catenin〕的表示出情况，免疫印迹结果显示无明显改变，讲明Ang1不是通过影响连接蛋白的表示出量调节BSCB的通透性。进一步通过免疫荧光技术发现，Ang1处理后支架蛋白ZO-1与钙黏蛋白VE-cadherin在细胞接触面的分布明显增加；除此之外，严密连接蛋白occludin与ZO-1,以及VE-cadherin与连环蛋白-catenin之间的互相作用也在Ang1处理后加强，且Ang1所引起的效应均可被PI3K-Akt途径抑制剂Wortmannin所抑制。综上结果表示清楚，Ang1可通过Akt改变连接蛋白在SCMEC细胞连接处的分布状态，并影响连接蛋白之间的直接作用，进而改变BSCB的通透性及屏障功能，该结论仍需进一步在体内研究中进行验证。除此之外，Ang1还可通过其他途径介入维持血管稳定性及诱导新血管生成，如有研究表示清楚Ang1可促进胞浆素和金属基质蛋白酶-2〔MMP-2〕的分泌和基底膜的降解，进而促进内皮迁移和管状构造生成，还可通过降低血小板内皮细胞粘附分子〔PECAM〕的磷酸化加强内皮间的连接，维持微血管壁的完好性[19]等等，这些信号转导分子在Ang1调节BSCB屏障功能的经过中能否发挥作用仍需进一步的研究说明。以下为参考文献〔References〕：[1]ABBOTTNJ,PATABENDIGEAA,DOLMANDE,etal.Structureandfunctionoftheblood-brainbarrier[J].Neurobio-lo-g