第9章2-化学键合相色法非极性键

14:301第九章－2

化学键合相色谱非极性键合相色谱14:302正相键合相色谱VS

反相键合相色谱键合相极性>流动相极性键合相极性<流动相极性正相键合相色谱反相键合相色谱14:303一、概 述

非极性键合相色谱，又称反相HPLC(reversedphaseHPLC,RP-HPLC),或反相键合相色谱（RPBC）：硅胶表面键合了非极性有机基团(烃基硅烷)的固定相。常见的烃基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基，其中以十八烷基键合相（简称ODS或C18）应用最广泛。14:304二、分离机理

1、疏溶剂作用理论

2、双保留机理1、疏溶剂作用理论

Horvath1976年在“JChromatogrphy”首次提出；

“Solvophobicinteractionsinliquidwithnon-polarstationaryphases,”

用于解释反相液相色谱的保留机制1、疏溶剂作用理论1）“分子毛”疏溶剂作用理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学键合的十八烷基（或其它烃基）的“分子毛”。强疏水性溶质分子=非极性部分+极性官能团部分2）溶质分子（分析物）3）“疏溶剂效应”

——

solvophobicinteraction当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相互间产生斥力。此现象称为“疏溶剂”。当键合相表面的烷基（分子毛）与极性溶剂接触时，相互间也产生斥力。而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基（分子毛）接触时，则相互间产生缔合作用。这种缔合作用是可逆的。这种缔合作用的强弱决定了溶质分子色谱保留的强弱。溶质分子的极性部分与极性溶剂具有亲和力。

当溶质进入到极性流动相中后，溶质分子（S）被流动相推动并与固定相接触时，溶质分子的非极性部分会与非极性固定相上的烷基(L)发生缔合作用，结合形成缔合物(LS)。这种疏溶剂的缔合作用是可逆的。

4）溶质保留值的影响因素溶质分子结构对保留值的影响烷基键合固定相特性对保留值的影响流动相性质对保留值的影响温度的影响①溶质分子结构对保留值的影响

在一定的洗脱液和温度下，溶质分子的logk与溶质分子中的非极性部分总表面成正比。

非洛普AB

溶质分子中非极性部分相同，而增加极性基团，则因为增加了溶质分子与洗脱液的极性分子间的作用力而使ｋ减小。REASON以下是降压药盐酸非洛普及其3个代谢物的化学结构，请讨论它们在非极性键合相色谱分离分析过程中的出峰先后顺序。盐酸非洛普的代谢物M3

盐酸非洛普的代谢物M2

盐酸非洛普的代谢物M1

盐酸非洛普

烷基键合固定相特性对保留值的影响A.烷基数量越多，溶质保留越强。B.烷基碳链越长，溶质保留越强随着烷基碳链的增长，增加了键合相的非极性作用的表面积，其不仅影响溶质的保留值，还影响色谱柱的选择性，即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。烷基键合固定相特性对保留值的影响例：

地西泮分别在C18柱和C8柱上的色谱保留流动相：甲醇-水（80︰20）；1.C18柱上的色谱图；2.C8柱上的色谱图烷基键合固定相碳链的碳原子数lgk洗脱液：水：甲醇（90：10）洗脱液：水：甲醇（10：90）反相HPLC中烷基键合相碳链长度及流动相中有机相比例对某物质保留值的影响流动相性质对保留值的影响

流动相的表面张力

流动相的表面张力越大→解缔合时释放的能量越多→ｋ越大。流动相极性表面张力ｋ（有机溶剂）温度的影响温度升高，保留值降低；温度升高，柱效提高。2、双保留机理双保留机理——

溶质的保留值应包括两部分的贡献，即疏溶剂效应和亲硅醇基效应。“亲硅醇基效应”——

silanophilicinteraction

烷基键合相表面往往还有残余硅醇基，这是一种微量酸性的基团，可与溶质阳离子或氢键基团相互作用，主要影响含氮类药物的分离，造成色谱峰拖尾，柱效下降。

加扫尾剂。一般常用的扫尾剂为有机碱类，如三乙胺等。其扫尾作用，主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟基作用，降低了硅胶的吸附作用。解决办法流动相中加入三乙胺后对普萘洛尔在C18柱上色谱行为的影响甲醇-水（70׃30）

2.甲醇-水-三乙胺-乙酸（70׃30׃0.5׃0.5）甲醇-水（40：60）甲醇-水+三乙胺n-普鲁卡因酰胺普鲁卡因胺n-普鲁卡因酰胺普鲁卡因胺Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.00Column:HP-C18(5m,120Å,4.6x250mm,)Mobilephase:ACN:1%H3PO4=0.3:99.7Flowrate:1.0mL/minColumntem.:RTWavelength:210nmInjectionVolume:10.0mL用流动相稀释原样品溶液梓醇

3。溶样溶剂的影响溶剂效应：注意用流动相稀释样品14:3029三、流动相常用流动相溶质保留值随溶剂极性变化的一般规律反相键合相色谱的流动相选择1、分离中性化合物的流动相

强极性溶剂（水、醇、乙腈）溶剂极性越低，其洗脱能力越强溶剂强度：水<甲醇<乙腈<四氢呋喃14:3031系统（2）较系统（1）好，原因如下：

A）系统（2）的粘度较系统（1）小，柱效好些。（注：粘度↓→柱压↓，传质阻力↓（溶质扩散阻力↓）→柱效↑）

B）乙腈的紫外末端吸收较甲醇小，在低波长处测定时，基线波动较甲醇小，测定误差小。常用流动相（1）甲醇—水（2）乙腈—水（3）四氢呋喃—水2、反相色谱法的流动相选择（1）二元溶剂系统一般以洗脱能力最弱的水作为底剂，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的首选极性调节剂为甲醇与乙腈。

在反相色谱中，有机相比例减小：（1）溶剂的极性增加，洗脱能力降低，溶质的保留时间增加。（2）不同溶质组分之间的分离度增加；（3）溶质的柱效下降。溶质在反相色谱柱上的保留行为随有机相组成变化的一般规律C18柱(15cm×0.46cm)，流量1.5ml/L，t0=1.0min反相HPLC改变流动相中有机溶剂比例对化合物A、B、C、D保留值的影响（2）多元溶剂系统在二元溶剂系统中加入少量的四氢呋喃，常能改善某些难分离的物质对的分离度。用水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，组成三元或四元溶剂系统，并进行优化，选出最佳溶剂系统。1.苯甲醇；2.苯酚；3.3-苯丙醇；4.2,4-二甲酚；5.苯；6.酞酸二乙酯32％THF流动相中加入四氢呋喃对分离度的改善3、极性化合物的保留酸性化合物碱性化合物pKa3.0≤pKa≤7.0pKa＜3.07.0≤pKa≤8.0pKa＞8.0方法离子抑制色谱法（ionsuppressionchromatography，ISC）

离子对色谱法（ion-pairchromatography，IPC）离子抑制色谱法离子对色谱法离子抑制色谱在反相色谱中常向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液，以使流动相的pH值控制在一定的数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性。分析有机弱酸加入0.05%的磷酸（pH:2.0），0.1-1％的甲酸或乙酸，可抑制溶质的离子化，获得对称的色谱峰。ChP2010用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充剂，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)为流动相，检查阿司匹林中游离水杨酸杂质。pKa=3.492.95流动相：100﹪水流动相：20%-80%MeOH,in20min流动相：H2O:CH3OH:H3PO4=95:5:0.05（FromSepax）

蘑菇提取物的分析样品组分：核苷酸离子抑制色谱法分离不同pKa值的化合物：通过控制流动相pH值的方式进行分离缓冲溶液的要求1。要有一定的缓冲容量，但是过高的缓冲液会损害色谱柱，不要超过50mM.2。要与检测体系匹配，常用的磷酸盐缓冲液不挥发，没有紫外吸收，多用于紫外检测器；醋酸铵盐系统挥发性好，可用于ELSD、MS检测器；3。注意缓冲液在有机溶剂中溶解度较小，因此采用梯度洗脱时要特别注意避免出现盐析现象。图9-36

流动相p