发酵技术第二章菌种的选育保藏与培养

发酵技术第二章菌种的选育保藏与培养第一页，共五十一页，2022年，8月28日2.1工业常用微生物常用菌种（一）细菌（bacteria）醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）芽孢杆菌属（Bacillus）短杆菌属（Brevibacterium）棒杆菌属（Corynebacterium）第二页，共五十一页，2022年，8月28日(1)细菌的结构第三页，共五十一页，2022年，8月28日第四页，共五十一页，2022年，8月28日（二）酵母（yeast）1.酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2.假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candidautilis）3.毕赤酵母属（Pichia）第五页，共五十一页，2022年，8月28日

酵母的菌落第六页，共五十一页，2022年，8月28日

第七页，共五十一页，2022年，8月28日（三）霉菌（mould）霉菌的菌落第八页，共五十一页，2022年，8月28日霉菌孢子结构第九页，共五十一页，2022年，8月28日（四）放线菌actinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素(antibiotic)(1)放线菌的形态第十页，共五十一页，2022年，8月28日(2)放线菌的结构气生菌丝孢子丝孢子基内菌丝培养基第十一页，共五十一页，2022年，8月28日菌种获得渠道从菌种保藏机构直接购买所需的菌株从自然界或现有菌种中分离筛选菌种从筛选出的菌种进行改良从而获得新菌种第十二页，共五十一页，2022年，8月28日国内菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏中心：中科院微生物研究所2）农业微生物保藏管理中心：中国农科院3）工业微生物保藏管理中心：中国食品发酵工业研究院4）医药微生物保藏管理中心：5）兽医微生物保藏管理中心：农业部兽医微生物研究所6）CCTCC:ChineseCentreforTypeCulturesCollections,WuhanUniversity,Wuhan,Hubei,430072,China.细菌：卫生部真菌：中国医科院皮肤病研究所（南京）病毒：中国医科院病毒所新抗生素：四川抗生素工业研究所生产用抗生素：华北制药厂

第十三页，共五十一页，2022年，8月28日1）美国典型菌种收藏馆（ATCC）2）美国农业研究服务处菌种收藏馆3）英国国立标准菌种贮藏所：4）法国巴斯德研究所：教学科研免费5）德国微生物和细胞收藏所6）日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）国外菌种保藏机构不承担鉴定业务，工业菌种收费保藏，教学科研菌种免费供应不收集不能形成冻干保存的菌种第十四页，共五十一页，2022年，8月28日2.2菌种选育菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和产生菌的遗传学研究等方面也发挥了重大作用。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。第十五页，共五十一页，2022年，8月28日一、自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育。自然选育：从自然界分离获得菌株根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。第十六页，共五十一页，2022年，8月28日1.从自然界分离获得菌株采样增殖培养纯种分离及纯培养生产性能测定第十七页，共五十一页，2022年，8月28日定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖培养：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。纯种分离及纯培养：利用分离技术得到纯种。生产性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

第十八页，共五十一页，2022年，8月28日菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料

↓

设计实验方案

↓确定采集样品的生态环境

采样

↓确定特定的增殖条件

增殖培养

↓确定特殊的选择培养基及可能的

↓定性或半定量快速检出法

平板分离

↓第十九页，共五十一页，2022年，8月28日

原种斜面

↓确定发酵培养基础条件

筛选

↓

初筛（1株1瓶）

↓

复筛（1株3～5瓶）

↓结合初步工艺条件摸索

再复筛（1株3～5瓶）

↓

3～5株

↓

单株纯种分离

↓生产性能试验

↓→毒性试验

菌种鉴定第二十页，共五十一页，2022年，8月28日

（一）采样1、采样地点以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。第二十一页，共五十一页，2022年，8月28日从自然界筛选第二十二页，共五十一页，2022年，8月28日

2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第二十三页，共五十一页，2022年，8月28日（二）增殖培养

样品含所需菌种较多，可直接分离;样品含所需菌种很少，就要设法增加数量(增殖或富集培养)。

增殖培养:就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。第二十四页，共五十一页，2022年，8月28日

增殖培养增殖培养具体措施

控制培养基碳源种类某一特定物质为唯一碳源或氮源

控制培养条件根据目的微生物的特殊要求进行控制培养高温、高压

添加某些抑制因子或促进因子抗真菌剂、促进因子

往往几种措施并用第二十五页，共五十一页，2022年，8月28日增殖培养例如：酒精酵母—含糖、酒精、低pH

纤维素酶产生菌—纤维素唯一碳源放线菌—添加10%酚数滴(抑制霉菌和细菌).........................营养和条件无穷尽的组合可从自然界分离大量的特定微生物。第二十六页，共五十一页，2022年，8月28日抑制剂的使用加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落的rosebengal等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌的分出率；加入某些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类的放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。第二十七页，共五十一页，2022年，8月28日第二十八页，共五十一页，2022年，8月28日第二十九页，共五十一页，2022年，8月28日第三十页，共五十一页，2022年，8月28日实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落。从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓第三十一页，共五十一页，2022年，8月28日（三）纯种分离及纯培养

A.增殖培养还不能得到微生物的纯种，生产菌在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。

B.要分离纯化获得纯种,必须将培养物制备成单孢子或单细胞悬浮液,经适当稀释后在琼脂平板上进行划线或稀释分离才能得到纯种。

第三十二页，共五十一页，2022年，8月28日

分离培养要点：制备单孢子悬浮液、适当稀释、选择培养基上分离培养条件对筛选结果影响也很大，可通过控制营养成分、pH、抑制剂、温度和通气及热处理等来提高筛选效率。第三十三页，共五十一页，2022年，8月28日分离方法稀释法是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。

第三十四页，共五十一页，2022年，8月28日利用选择平板进行直接分离第三十五页，共五十一页，2022年，8月28日1.稀释平皿分离法1.稀释分离法99ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释第三十六页，共五十一页，2022年，8月28日1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法第三十七页，共五十一页，2022年，8月28日分离方法划线法

单细胞微生物(细菌、酵母菌)是将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法、方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。划线法简单且较快。

第三十八页，共五十一页，2022年，8月28日2.划线分离法

a.分区划线分离法b.连续划线分离法第三十九页，共五十一页，2022年，8月28日固体培养基四区划法接种法ABCDAABABC第四十页，共五十一页，2022年，8月28日（3）组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离第四十一页，共五十一页，2022年，8月28日（四）生产性能的测定第四十二页，共五十一页，2022年，8月28日2.从自发突变体中获得菌株变异是育种的基础。在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。第四十三页，共五十一页，2022年，8月28日自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株——诱变育种。第四十四页，共五十一页，2022年，8月28日二、微生物菌种的诱变选育第四十五页，共五十一页，2022年，8月28日二、微生物菌种的诱变选育

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂.诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍第四十六页，共五十一页，2022年，8月28日1.出发菌株的选择：

出发菌株———用来育种处理的起始菌株.

.◆出发菌株应具备：

①对诱变剂的敏感性高；

②变异幅度大、产量高；

◆出发菌株的来源；

①自然界直接分离到的野生型菌株：

②生产中正在使用的菌种：

③菌种保藏机构购买：诱变育种的一般步骤第四十七页，共五十一页，2022年，8月28日菌种分离方法透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法第四十八页，共五十一页，2022年，8月28日二、菌种鉴定多相分类分子分类化学分类数值分类传统分类计算机应用形态、生理生化特征细胞壁、细胞膜组成和结构等DNA，RNA等利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。第四十九页，共五十一页，2022年，8月28日1、经典分类鉴定方法形态学特征生理生化特征血清学试验和噬菌体分型第五十页，共五十一页，2022年，8月28日特征分析方法观察点菌体染色反应革兰氏