色谱基础原理

研究植物叶子的组成时，他将植物色素的石油醚浸取液通过填充有碳酸钙的直立玻璃管，再用纯净的石油醚自上而下淋洗，随着淋洗的进行，发现不同色素向下移动的速度不同，最后色素中各组分互相分离，形成不同颜色的谱带。

1906年由俄国植物学家Tswett创立色谱柱流动相固定相石油醚色谱原型装置玻璃管碳酸钙谱带色谱法的起源2023/1/3011968年前后高效液相色谱法1975年离子色谱法80年代初超临界流体色谱法80年代中后期毛细管电泳法90年代后期毛细管电色谱法目前手性分离色谱、高分辨色谱、多维色谱1935年离子交换柱色谱法1941年液液分配柱色谱法1944年纸色谱法1952年气相色谱法1956年薄层色谱法1959年凝胶柱色谱法色谱方法的发展历史2023/1/302色谱发展初期，Martin等人借助分馏中的塔板概念，把色谱柱设想为由许多塔板组成的分馏塔，把色谱分离过程比拟作分馏过程，提出了表达柱效能模式的塔板理论。012345LH色谱柱ΔVL:色谱柱柱长;H:

理论塔板高度;ΔV：样品体积（1）塔板理论2023/1/303

塔板理论的假设：

(1)每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；

(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；

(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；

(4)每次分配的分配系数相同。

1.塔板理论（platetheory）

半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标2023/1/304

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!理论塔板数与色谱参数之间的关系为：

n=L/H色谱峰的方差与柱长或保留时间的关系为：色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标2023/1/305色谱兴起之后，科学家们在实际研究中发现得到的色谱峰往往是展宽的图形，塔板理论无法解释这种现象。为此，荷兰学者VanDeemter等人于1956年提出了速率理论。该理论吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念，并同时考虑影响理论塔板高度的动力学因素（涡流扩散、分子扩散、传质阻力、载气流速等

），研究色谱分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响，对色谱分离条件的选择具有指导意义。

速率理论为色谱法的实践提供了理论指导，同时为高效液相色谱法的创建提供了启迪和依据。（2）速率理论2023/1/3061.速率方程（也称范·弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，

u：载气的线速率(cm/s)。

减小A、B、C三项可提高柱效。存在着最佳流速。

A，B，C三项各与哪些因素有关？色谱理论：速率理论-影响柱效的因素2023/1/307载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效

H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。载气流速与柱效——最佳流速2023/1/308

(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散、传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。

(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。

(3)为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。

(4)各种因素相互制约：载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。速率理论的要点：2023/1/309随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱法(4)流动相固定相类型液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱

液相色谱LC

气相色谱GC(1)(2)(3)SFC超临界流体色谱超临界流体1、按流动相和固定相的状态分类2023/1/3010柱色谱平面色谱固定相装在管柱内固定相呈平面状填充柱色谱毛细管柱色谱按照管柱的粗细和固定相的填充方式高分子薄膜色谱薄层色谱纸色谱按平面材料的不同2、按固定相的操作形式分类2023/1/3011色谱法气相色谱法液相色谱法超临界流体色谱法填充柱色谱法毛细管柱色谱法平面色谱法柱色谱法经典液相柱色谱法高效液相色谱法薄层色谱法纸色谱法高分子薄膜色谱法3、色谱法的简单分类2023/1/3012吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法尺寸排阻色谱法亲和色谱法生物色谱法4、按色谱过程的分离机制分类2023/1/3013（1）

吸附色谱法：用固体吸附剂作固定相，根据样品中不同组分在吸附剂上的物理吸附性能的差异进行分离。如气固色谱法、液固色谱法。（2）分配色谱法：用液体做固定相，根据不同组分在固定相（液体）和流动相之间分配系数的不同进行分离。如气液色谱法、液液色谱法。4、按色谱过程的分离机制分类2023/1/3014（3）离子交换色谱法：固定相是离子交换剂，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别进行分离。（4）尺寸排阻色谱法：又叫凝胶色谱法或空间排阻色谱法，用多孔性凝胶作固定相，根据不同大小的组分分子在多孔性凝胶中的选择性渗透进行分离。4、按色谱过程的分离机制分类2023/1/3015（5）亲和色谱法：以在不同基体上键合多种不同特征的配体作固定相（称固定化分子），根据不同组分与固定相的高专属性亲和力进行分离。（6）生物色谱法：采用各种具有生物活性的材料（例如：酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等）作固定相，利用固定相与各种生物活性物质的选择性结合进行分离。4、按色谱过程的分离机制分类2023/1/3016正相色谱离子色谱反相色谱HILICSFC常用的液相色谱技术2023/1/3017增加容量因子κ增加柱效N增加分离因子α两个组分分离峰对于色谱而言，影响分离度的三个因素中，分离因子最为重要。影响分离因子的因素固定相类型固定相生产商-不同品牌的相同固定相，也有很大的选择性差别pH值流动相-甲醇，乙腈，THF以及不同比例的混合物。影响色谱分离度的因素2023/1/3018

组分在固定相和流动相间发生的吸附、解吸，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离的依据。分配系数(

partitioncoefficient)K2023/1/3019

一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。分配系数K

的讨论：2023/1/3020△Go------相对于标准状态的组分自由能R---------气体常数Tc--------柱温一般，温度上升20℃，K值约下降一半。分配系数与柱温的关系

2023/1/3021一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

3.分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)和容量比(capacityradio)；3.分配比（partitionradio）k2023/1/3022(二)分配系数和容量因子与保留时间的关系设流动相的线速度为u，组分的速度为v，将二者之比称为保留比：分配系数和容量因子的关系3.分配比（partitionradio）k

2023/1/30233.分配比(partitionradio)k

2023/1/3024输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统高效液相色谱仪组成2023/1/302526高效液相色谱组成2023/1/301.在线脱气机(G1322A/G1379A)2.四元／二元/单元泵(G1311A/G1312A/G1310A)3.自动进样器(G1313A)4.二极管阵列检测器(G1315B)5.可变波长紫外检测器（G1314A)1100HPLCMaintenance&Troubleshooting2023/1/3027Agilent1100系列HPLC2023/1/3028在线脱气机(G1322A/G1379A)Agilent1100在线脱气机2023/1/3029工作原理Agilent1100在线脱气机2023/1/3030何时需要使用Agilent1100在线脱气机Agilent1100在线脱气机2023/1/3031脱气机的操作：操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30ml，对微脱气机10ml）冲洗真空脱气机，特别是当泵关闭了一段时间后（如过夜），以及在通道中使用挥发性混合溶剂时。标准脱气机（G1322A).

标准脱气机每个通道体积为12ml建议排液操作：5ml/min排液6min以上。微脱气机（G1379A).微脱每个通道体积为1ml建议排液操作：2ml/min排液5min。切勿用5ml/min流速去排液。Agilent1100在线脱气机-在线脱气机(G1322A/G1379A)2023/1/303233使用Agilent1100在线脱气机须知溶剂

用棕色玻璃瓶装水溶液，可以避免藻类的生长。

过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。避免使用下述可腐蚀钢铁的溶剂：碱金属卤化物及其酸溶液(如：碘化锂、氯化钾等)。

高浓度无机酸，如硝酸、硫酸.

可能含有过氧化物的色谱纯醚(如THF、二氧六环、二丙基乙醚)。这些在使用前必须用干燥氧化铝过滤除去过氧化物。

含强络合剂的溶液(如EDTA，乙二胺四乙酸)。

四氯化碳与2-异丙醇或四氢呋喃的混合液。Agilent1100在线脱气机2023/1/3033防止堵塞溶剂过滤器及真空腔污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵的运行。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH

4至7)中尤其如此。下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。使用灭过菌的溶剂瓶来减缓藻类生长。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液（建议不超过两天）。如果应用许可，在溶剂中加人0.0001－0.001

M的叠氮化钠。避免溶剂瓶暴露在直射阳光下。用氩气置换流动相上层的空气。长期不用时用水清洗水溶液通道并置换为甲醇Agilent1100在线脱气机日常维护,故障诊断2023/1/3034检查溶剂过滤器－拧开脱气机出口或比例阀入口管线，并使液面高于出口30cm此时溶剂会因为重力流出，脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出。－查看过滤器是否变色．－临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常．清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器放在装有浓硝酸（35％）的烧杯里浸一小时。用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不使用超声波清洗机清洗。将过滤器重新装好。建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统．可能会严重堵塞系统Agilent1100在线脱气机日常维护,故障诊断2023/1/3035Question?1.如何简单判断脱气机脱气是否正常？打开Purge阀，设定泵的流速2ml/min，提起当前所使用溶剂瓶内的溶剂过滤头，使之脱离液面一小段时间，此时溶剂传送管内会产生一小段气泡，放下过滤头，让此段气泡通过脱气机，如果脱气机正常，气泡应消失或缩小。2.如何简单判断脱气机腔体或溶剂过滤头是否堵塞？

关闭泵，拧开脱气机出口或比例阀入口管线,此时溶剂会因为重力流出，脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶剂会流出不畅或不流出。Agilent1100在线脱气机日常维护2023/1/3036Agilent1100四元泵(G1311A)2023/1/3037Agilent1100四元泵工作原理2023/1/3038Agilent1100泵头(PumpHead)结构图Agilent1100泵2023/1/3039Agilent1100系列泵使用须知Agilent四元／二元/单元泵日常维护2023/1/3040多通道梯度阀（MCGV）操作要点当盐溶液和有机溶剂混合时，盐溶液可能与有机溶剂完全混溶，而不会出现沉淀。但是在梯度阀的混合点，重力作用有可能使盐颗粒沉淀下来。通常，阀的A通道用于水相/盐溶液，而泵的B通道用于有机溶剂。如果使用的是这样的配置，盐将落回到盐溶液中，并被溶解。当泵使用的不同配置（例如，D-盐溶液，A-有机溶剂）时，盐可能会落到有机溶剂中，从而出现问题。Agilent1100四元泵中使用盐溶液和有机溶剂时，建议将盐溶液接到下面的口上，有机溶剂接到上面的梯度阀口上。有机溶剂通道最好直接在盐溶液通道的上面。建议定期用水冲洗所有MCGV通道，以去除在阀口上可能出现的盐沉淀。

Agilent四元／二元/单元泵日常维护2023/1/3041更好地使用四元泵

将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面(或较高处)。当在四元泵上使用盐溶液或有机溶剂时，建议将盐溶液接在底部得梯度阀口上，将有机溶剂接在上面得梯度阀口上。有机通道最好在盐溶液通道得上面。建议用水定期冲洗所有MCGV通道除去可能在阀口析出得盐结晶。操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30ml，对微脱气机10ml）冲洗真空脱气机，特别是当泵关闭了一段时间后（例如，过夜），以及在通道中使用挥发性混合溶剂时。防止溶剂过滤器堵塞及长菌。当虑器表面有黑色或黄色污染层说明虑器发生了堵塞，请立即清洗或更换之。定期检查排液阀的虑芯。检查方法：拧开排液阀，以水作流动相，流速5ml/min，若压力大于10bar,则须立即更换。

Agilent四元／二元/单元泵日常维护2023/1/3042更好地使用泵当使用低流速时（不高于0.2

ml/min）检查所有1/16英寸接头有无渗漏（用压力测试或漏液测试）。每当更换泵密封圈时排液阀虑芯也应更换。更换活塞密封垫时检查活塞杆上是否有划痕。有划痕的活塞将导致轻度渗漏，并降低密封垫的使用寿命。应尽早更换有划痕的活塞。使用缓冲溶液时，关泵前先用水冲洗系统。当需要长时间使用0.1摩尔或更高浓度得缓冲液时，最好选用密封垫清洗附件，以减少对密封垫及活塞杆的磨损。更换活塞密封垫后应按照密封垫安装步骤对其进行磨合，但磨合不适用于正相密封垫。Agilent1100系列泵的使用须知2023/1/3043

更好地使用泵

当泵头安装有冲洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇，并将其流速调至约20滴/分钟使这溶液流过冲洗装置。10％异丙醇有助于降低水的表面张力，并有抑菌作用。最好不要用其它溶剂代替。

当泵头安装有冲洗附件而不开启10％异丙醇，会使密封垫及活塞杆的寿命减短。Agilent1100系列泵的使用须知2023/1/3044密封垫磨合操作：1.以异丙醇作为溶剂并将其管道直接连接到主动阀(四元泵需一接头，部件号0100－1847）。2.连接阻尼管（部件号5022－2159）于排液阀的出口，阻尼管的另一端置于废液瓶中。3.打开排液阀，并用异丙醇以2ml/min的流速冲洗系统10分钟。4.关闭排液阀，设置流速使压力达到350bar，并使系统在此压力下保持15分钟。5.关闭泵，缓慢打开排液阀释放压力，重新连接管路，然后冲洗系统中的异丙醇。注意，只有反相密封垫（5063－6589）才需此操作而正相密封垫（0905－1420）因其最高只耐受200bar,所以此操作会损害它。Agilent1100系列泵的使用须知2023/1/30451.更换排液阀虑芯2.清洗,更换主动阀阀芯3.清洗球形单向阀4.更换密封垫，活塞杆Agilent四元／二元/单元泵日常维护2023/1/3046Question?1.如何简单判断比例阀是否内漏？

设定泵使用一个单独通路（A），打开Purge阀，流速5ml/min，提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离开液面，观察这些通路（B、C、D）内的溶剂是否随着流动，正常时均不应流动。2.何时应该更换Purge阀内的过滤白头？

使用纯水作流动相，打开Purge阀，流速5ml/min，观察系统压力，如果超过10bar，应该更换。3.泵压力不正常可能由那些原因引起？

气泡，主动阀故障，出口阀故障，密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞，比例阀故障，传感器故障，使用比例阀混合时盐浓度太高Agilent1100系列泵的日常维护2023/1/3047Agilent1100自动进样器(G1313A)2023/1/3048Agilent1100自动进样器工作原理2023/1/3049Agilent1100自动进样器工作原理2023/1/3050Agilent1100自动进样器使用须知2023/1/3051更换转子密封圈更换针及针座Agilent1100自动进样器日常维护2023/1/3052Agilent1100柱温箱器使用注意事项及日常维护2023/1/3053连接的管路尽量短，防止热扩散及峰增宽。如果使用小体积分析柱以及流速小于0.2ml/min时建议使用左边的柱温箱(左边体积较少,3ul).除非特殊应用，建议将两边温度设置一样。并确保关好前盖。Agilent1100柱温箱器使用注意事项及日常维护2023/1/3054Agilent1100二极管阵列检测器(G1315B)2023/1/3055Agilent1100二极管阵列检测器工作原理2023/1/3056可变的光进口狭缝系统这一微型狭缝系统是利用硅的机械性能和总体布局微型加工技术以及精确的制作功能加工而成，它把所需的光学性能－狭缝和光栅－集中组合到一起，成为一个简单、紧凑的元件。狭缝宽度直接由仪器上的微处理器来控制，并可用为设定分析方法的一个实验参数。光栅用一个凹面全息光栅来实现分光和光谱成像，光栅把入射光束全部分散成组成它的波长，然后把它反射到二极管阵列上。二极管阵列二极管阵列由1024个光电二极管和一个位于陶瓷基座上的电路组成，在190

---950

nm范围内取样间隔<

1

nm。Agilent1100二极管阵列检测器工作原理2023/1/3057灯紫外区域采用有通光狭缝的氘灯作光源，低压氘气体的等离子体能发出190nm到大约800

nm的光。可见光（VIS）和近红外光采用