实验四核酸检测细菌16srdna扩增

实验四

核酸扩增-----细菌16SrDNA检测朱诗应实验目的掌握聚合酶链反应(PCR)的基本原理；掌握常规PCR实验操作技术；熟悉琼脂糖凝胶电泳技术；了解生物战剂细菌16SrDNA检测方法。常规PCR仪琼脂糖凝胶电泳电泳槽图1常规PCR操作流程一、PCR技术原理

PolymeraseChainReaction（PCR）

-聚合酶链式反应1985年美国PE-Cetus公司的Mullis等发明，1993年获诺贝尔化学奖变性（denaturation）：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。退火（annealling）：将下降至适宜温度（一般较Tm低5℃），引物与变性的DNA单链（模板）在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双链。由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNA浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNA单链之间的互补结合。

延伸（extension）：将温度上升至在70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的从5’3’端DNA链延伸反应，随着4种dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的掺入，合成新的DNA互补链。设原始模板浓度为1，经过n个反应周期后，长产物片段浓度仍为n。而短产物片段浓度为总浓度减去长产物片段和原始模板的浓度，即2n-n-1。只有短产物片段才是预期的扩增片段，与短产物片段相比，长产物片段的浓度是微不足道的。随着反应周期的增加，两者的数量差越来越大，以至长产物片段可以被忽略不计。

（一）PCR反应体系

模板DNA、四种dNTP（dATP、dTTP、dGTP及dCTP）引物TaqDNA聚合酶及缓冲液含Mg2＋模板（template）来源于任何生物的基因组DNA质粒DNAcDNA（RNA如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等经逆转录而成的）核酸标本来源广泛：纯培养的细胞或微生物、临床标本（血、尿、粪便、体腔各液、漱口水等）、犯罪现场标本（血斑、毛发、精斑等）和病理解剖标本（新鲜的或经甲醛固定石蜡包理组织）以及考古标本等。提取、纯化核酸引物（primers）人工合成的的寡核苷酸序列设计要合理：特异性、长度、碱基组成、二级结构、5’端和3’端、

设计引物的计算机软件纯化保存反应终浓度一般为0.1-0.5umol/LDNA聚合酶普通TaqDNA聚合酶没有3’~5’外切酶活性，缺乏校正功能合适浓度0.5-5U/100ul反应体系中对于PCR的忠实性要求很高时（如DNA测序、基因克隆等），应使用Pfu等具有3’~5’外切酶活性的聚合酶，减少dNTP的错误掺入率，提高PCR的忠实性热启动：AmpliTaqGold＠酶三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）dATP、dTTP、dGTP、dCTP贮存液，其浓度一般为5-10mmol／L反应终浓度dNTP应为50-200umol/L4种dNTP的浓度要相等（等摩尔）为防污染，控制假阳性的产生，可用dUTP代替dTTP,使用尿苷酶（UNG）控制PCR产物交叉污染。PCR缓冲液（PCRbuffer）

一般组成为：50mmol/LKCl，10-50mmol／LTris-HCl（室温，pH8.3）1.5mmol／LMgCl210X浓度母液mg2+浓度稳定剂和增强剂（0.01％明胶，5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)，100ug／ml小牛血清白蛋白）50ulPCR反应体系的组成①样品DNA1～3ul；②正链引物（25umol／L）1.0ul；③负链引物（25umol／L）1.0ul；④脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10xPCR缓冲液及5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3ul；⑦TaqDNA聚合酶1-2.5U；⑧蒸馏的去离子水补至50ul，短暂离心混匀。阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。（二）PCR扩增产物的检测与分析琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR-限制性片段长度多态性分析核酸探针杂交（点杂交、微孔板杂交、Southern印迹杂交,等）PCR-ELISAPCR产物测序琼脂糖凝胶电泳法DNA分子在电泳缓冲液（偏碱性）里带负电荷溴化乙锭（EB）电泳迁移率琼脂糖凝胶浓度紫外线照射电泳槽（三）PCR衍生技术逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）套式PCR（nestedPCR）多重PCR（multiplexPCR）也称复合PCR：

多对引物（四）PCR污染及预防措施（8）每次PCR操作都应设阳性及阴性对照：【注意事项】

防止假阳性的出现1.防止靶DNA的污染在实验操作中应特别注意：（1）PCR产物是最主要的污染源。（2）含有靶DNA序列的质粒的污染。（3）阳性对照的污染。（4）标本之间的交叉污染。（5）在采集标本时，其他污染源带来的污染。2.防止非靶DNA的污染（1）在应用RT-PCR检测RNA时，存在可以扩增的DNA。（2）片段长度与正常PCR扩增产物相似的非靶DNA的存在。（3）对非特异扩增产物误判。（4）无意义的特异性序列的污染（死的病原体DNA）。防止假阴性的出现

1．标本处理的原因（1）处理标本时，靶DNA丢失。（2）处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。（3）标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2．PCR试剂问题（1）TaqDNA聚合酶失活。（2）mg2+浓度过低或是没有加。

3．PCR扩增仪故障或扩增过程中的原因

4．PCR产物鉴定中的问题（1）电泳时没有加溴化乙锭。（2）电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。（3）凝胶浓度过低，使扩增带跑散。引物二聚体

形成引物二聚体的原因有：（1）两个引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。（2）引物-模板比例太高，可增加模板用量。（3）退火温度过低。（4）热循环次数过多。

造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施（1）引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。（2）TaqDNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。（3）mg2+浓度过高，可适当调节mg2+浓度。（4）退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用两温循环PCR进行扩增。（5）热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。二、细菌16SrDNA

扩增保守区的引物16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因，长度约为1500bp，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区（conservedregions）和与之相间的多个可变区(variableregions)组成。

PCR扩增16SrDNA包含两层涵义在保守区设计PCR通用引物，理论上可以将存在于待测标本中的各种细菌都扩增出来；选择可变区设计PCR特异性引物，则可以把标本中的细菌鉴定到属、种乃至于菌株的水平。因此16SrDNA已成为细菌鉴别与分类研究的较理想的靶序列。

注：V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9为可变区位置。F27、R534，F357、R926，F968、R1492为三对扩增引物。核苷酸序列及其位置是以大肠埃希菌为参考序列。

基于16SrDNA全长或部分序列的应用4.用于发现细菌新种类5.TheMicroSeq50016SrDNA细菌鉴定系统3.用于鉴定血液培养的细菌2.用于区分进化关系密切的细菌1.用于鉴定难以培养的细菌16SrDNA序列比对数据库①RDP-II：1991年美国密西根州立大学建立，可下载免费使用，其序列来自于GenBank公共数据库，序列数量庞大，截止2012年12月，注册的各类16SrRNA达2639157条。②MicroSeqID：1998年美国AppliedBiosystems公司研发的有偿使用软件，其与TheMicroSeq50016SrDNA细菌鉴定系统配套，包括16SrDNA5’端的527bp序