iPSC基因敲入服务和诱导分化

Tinge五哼ve:CfllSPR-^Tinge五哼ve:CfllSPR-^tLJarm•IktirlkbCRISPR-U™基因敲入iPSC细胞系：通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入iPSC细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。敲入方案:特定位点融合蛋白：gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，PSC细胞以外源携带敲入片段的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶位点。Wtld-t>pe&Jldo{ehranwEcmoX)

基因定点过表达:人类iPSC在hROSA26和AAVS1位点定点敲入感兴趣的基因，即可以避免片段在基因组随机插入，又可实现目标基因过表达。HDRdonor匚曰sScutting5iit巳PPP1R12Clocus(AAV51site)PGAPURO匸*G”區13护HDRdonor匚曰sScutting5iit巳PPP1R12Clocus(AAV51site)PGAPURO匸*G”區13护11皀GFPHA-LI4A.-R]HomclogousReccMnbinalkm*・・■"-・・R3源井生物的细胞系基因编辑专家使用CRISPR-U™技术设计您的安全港基因敲入iPSC模型，生成满足您特定研究需要的细胞系模型。应用案例：通过构建以AAVS1位点为靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA质粒和AAVS1-EF1a-F9cDNA嘌呤霉素donor载体，并将其导入iPSC。将F9cDNA成功插入AAVS1位点的iPSCs分化为肝细胞，在培养上清中成功检测到人因子1X(hFIX)抗原和活性。最后，通过脾脏注射将肝细胞移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠体内。F2 RJbid 斗』，oCRr5P^Cas9?BEffiiea b护讯誇. F2 RJbid 斗』，oCRr5P^Cas9?BEffiiea b护讯誇. si*Sei- IPVCa.-iPBC■- ^6Cv- iP3Ci-lr**rtBHi nwnifin ^*4*40* LnwitM ■aurifaut 用fi—A电®Sf■炖Jii声JsoionytM^ovp5tyfcry•AMI.| |讯超乐|purarr^Qn| |IAAV51EF1w|聘tDIMA|pmamyri松 j |iPSC转染48小时后，用嘌呤霉素进行药物筛选。大多数iPSCs在药物选择后死亡，但少数存活下来。大约7天后，每个存活的iPSC的克隆都长得足够大，可以在两组（图a，b）中进行进一步的插入检测。从中挑选出6个克隆。如图c所示，用引物可在所有iPSC克隆中检测到1.3kb的片段；用另外一对引物可在iPSC克隆1、2、3、4和6中检测到468bp和4.9kb的片段，表明F9cDNA杂合插入；在iPSC克隆5中只能检测到4.9kb的片段，表明F9cDNA纯合插入。参考文献:Lyu,Cuicui,etal."TargetedgenomeengineeringinhumaninducedpluripotentstemcellsfrompatientswithhemophiliaBusingtheCRISPR-Cas9system."Stemcellresearch&therapy9.1(2018):92.iPSC诱导分化由于人胚胎干细胞来源于早期胚胎而使其研究备受伦理争议，而且人胚胎干细胞来源的分化细胞进行异体移植时存在排斥反应，在一定程度上限制了其临床应用。iPSC来源于多种体细胞，可以诱导分化为不同种类的细胞用于科学研究。源井生物的iPSC技术平台集中在分化的开发上，提高了从患者组织（如成纤维细胞）或现有的iPSC中产生具有功能的、成熟的肝细胞、神经细胞、T细胞、心肌细胞、造血干细胞和胰岛细胞。实验流程iPSC西鹫程吋科使弓踊斗比优的范垢程方法将客户提供的组祝iP£C诱导并化枉iPH培弄