单核细胞增生李斯特氏菌及检验

第第页单核细胞增生李斯特氏菌及检验单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的平安具有危急，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威逼人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必需加以重视。一、生物学特性

1、形态与染色

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在养分丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培育中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

2、培育特性

该菌养分要求不高，在20--25℃培育有动力，穿刺培育25天可见倒立伞状生长，肉汤培育物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培育温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.84.4能缓慢生长，在6.5%NaCl肉汤中生长良好。在固体培育基上，菌落初始很小，透亮     ，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透亮     。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培育后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良McBride(MMA)琼脂上，用450角入射光照耀菌落，通过解剖镜垂直观看，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

3、生化反应

该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

4、血清型

依据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。

5、反抗力

该菌对理化因素反抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐反抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

二、流行病学

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很简单食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

三、致病性

单增李氏菌进入人体后是否发病，与菌的毒力和宿主的年龄、免疫状态有关，由于该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，易感者为新生儿、孕妇及40岁以上的成人，此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。该病的临床表现，健康成人个体消失稍微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：

1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；

2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；

3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培育物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。

四、检验和掌握

（一）检验

1、增菌培育

取回的样品应在4℃下处理、存放和运输，假如是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。

取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培育4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，连续培育20h和44h.。

2、分别

共培育24h和48h后，取EB培育物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3+LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培育24-48h，LPM平板在30℃培育24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照耀平板，通过目镜垂直向下观看查找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对比。

加入七叶苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落四周有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相像。

在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必需的，由于在PALCAM和OXA或LPM平板上分别菌落时可能沾有不行见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的缘由是一个样品中可能分别到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培育24-48h，假如不用于动力观看，也可在35℃培育。

3、鉴定步骤

（1）观看TSAYE平板通过斜射光观看，查找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对比。

（2）、从30℃或更低温度下培育的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观看。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。假如菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见稍微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对比相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。

（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶试验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。

（4）取16-24h的培育物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培育物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。

（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培育24h用做糖类发酵和其它生化项目试验。TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。

（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避开触到平板底部和使琼脂裂开，同时设阳性对比（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对比（英诺克李斯特氏菌），35℃培育48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。

（7）在光明的光照下，观看经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清楚的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。

（8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培育物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培育5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，消失紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色消失，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如消失紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必需进行这唯一的试验。本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，消失橙色表明硝酸盐已被还原。如未消失颜色反应，也加入少量锌粉，若消失橙色表明硝酸盐未被还原。

（9）将TSBYE培育物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培育7天，每日观看，李斯特氏菌呈典型伞状生长。在MTM中伞状生长更典型。同时，30℃的TSBYE培育物在油镜下可见细菌作翻转运动。

（10）将TSAYE肉汤培育物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培育7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖的状况见下表。全部李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。假如在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3+的LPM分别平板上菌落色素很明显，则七叶苷试验可免做。

李斯特氏菌属的区分

种别

溶血

硝酸盐

糖发酵

甘露醇

鼠李糖

木糖

单增李斯特氏菌

+

-

-

+

-

英诺克李斯特氏菌

-

-

-

V

-

威尔斯李斯特氏菌

-

-

-

V

+

西尔李斯特氏菌

+

-

-

-

+

格氏李斯特氏菌

-

-

+

V

-

绵羊李斯特氏菌

+

-

-

-

+

V:反应不定

4、血清学鉴定

下表显示了李斯特氏菌种间的血清学关系。

李斯特氏菌的血清学关系

种别

血清型

单增李斯特氏菌

1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、4B、4C、4D、4E、“7”

绵羊李斯特氏菌

5

英诺克李斯特氏菌

4AB、6A、6B、Un（未确定）

威尔李斯特氏菌

6A、6B

西尔李斯特氏菌

1/2B、4C、4D、6B、Un（未确定）

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