分子生物学大实验-目的基因的克隆和表达

分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述错误!未定义书签。一、聚合酶链式反映(PCR)错误!未定义书签。二、质粒概述错误!未定义书签。三、凝胶电泳错误!未定义书签。四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化错误!未定义书签。五、重组质粒的连接错误!未定义书签。六、限制性内切酶消化错误!未定义书签。七、SDS蛋白质电泳错误!未定义书签。第二节材料、设备及试剂错误!未定义书签。一、材料错误!未定义书签。二、设备错误!未定义书签。三、试剂：错误!未定义书签。第三节操作步骤错误!未定义书签。一、目的基因的取得：错误!未定义书签。二、pET-21bT(pET-21bR、pET-21b)载体的取得：错误!未定义书签。三、pET-21b等与目的片段的连接作用错误!未定义书签。四、转化大肠杆菌DH5a进行阳性克隆子挑选与鉴定错误!未定义书签。五、转化转化大肠杆菌BL21plyst,摇菌进行SDS电泳。错误!未定义书签。六、融合蛋白的毒力测定错误!未定义书签。第四节本实验的实验报告错误!未定义书签。第一节基因操作概述一、聚合酶链式反映（PCR）PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反映）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方式。它包括三个大体步骤：（1）变性（口0砥8代）：目的双链DNA片段在94℃下解链；（2）退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；（3）延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个大体步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，因此经25〜35轮循环就可使DNA扩增达106倍。（一）、PCR反映中的要紧成份1、引物：PCR反映产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循以下原那么：（1）引物长度约为16〜30bp,太短会降低退火温度阻碍引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长那么比较浪费，且难以合成。（2）引物中G+C含量一样为40%〜60%,可按下式粗略估量引物的解链温度Tm=4（G+C）+2（A+T）。（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。（6）两引物之间尤其在3'端不能互补,以防显现引物二聚体,减少产量。（7）引物5'端对扩增特异性阻碍不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点和标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1〜2个爱惜碱基。（8）引物不与模板结合位点之外的序列互补。一样PCR反映中的引物终浓度为〜DmoL/L。引物过量会产生错误引导或产生引物二聚体,太低那么降低产量。2、4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：dNTP应用NaOH将pH调至，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5〜10mmol/L并分装，-20℃贮存。一样反映中每种dNTP的终浓度为20〜200Dmol/L。3、Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶阻碍专门大，它可阻碍酶的活性和真实性，阻碍引物退火和解链温度，阻碍产物的特异性和引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为〜2mmol/L。关于一种新的PCR反映，能够用〜5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。4、模板：PCR反映必需以DNA为模板进行扩增，模板DNA能够是单链分子，也能够是双链分子，能够是线状分子，也能够是环状分子(线状分子比环状分子的扩增成效稍好)。就模板DNA而言，阻碍PCR的要紧因素是模板的数量和纯度。一样反映中的模板数量为102〜105个拷贝，关于单拷贝基因，这需要Pg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过量那么可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会阻碍PCR的效率。5、TaqDNA聚合酶：一样TaqDNA聚合酶活性半衰期为℃130min,95℃40min,97℃5min。此刻人们又发觉许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时刻。TaqDNA聚合酶的酶活性单位概念为74℃下，30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的犯错率，一样PCR中犯错率为2X10-4核苷酸/每轮循环。在100PlPCR反映中，〜2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可依照DNA、引物及其它因素的转变进行适当的增减。酶量过量会使产物非特异性增加,过少那么使产量降低。6、反映缓冲液：反映缓冲液一样含10〜50mmol/LTris-Cl(20℃下〜，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris•Cl在20℃时pH为〜，但在实际PCR反映中，pH为〜。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反映液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100Pg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳固酶活性。(二)、PCR反映参数1、变性：在第一轮循环前，在94℃下变性5〜10min超级重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),如此可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会专门快复性，减少DNA产量。一样变性温度与时刻为94℃1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时刻主若是为使反映体系完全达到适当的温度。2、退火：引物退火的温度和所需时刻的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度和引物的浓度。实际利用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一样当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。通常退火温度和时刻为37℃~55℃,1〜2min。3、延伸：延伸反映一样为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反映温度75℃。事实上，引物延伸在退火时即已开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃〜85℃。延伸反映时刻的长短取决于目的序列的长度和浓度。4、循环次数：当其它参数确信以后，循环次数要紧取决于DNA浓度。一样而言25〜30轮循环已经足够。循环次数过量，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25〜30轮循环扩增后，反映中TaqDNA聚合酶已经不足，若是现在产物量仍不够，需要进一步扩增。二、质粒概述把一个有效的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁衍和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA技术中经常使用的载体。质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳固遗传因子，大小从1〜200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒要紧发觉于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中维持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依托于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即便没有它们也能够正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相较，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部份非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方式肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有以下一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰操纵型；（2）具有多种经常使用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。经常使用的质粒载体大小一样在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒进程中，除超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。若是质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能够旋转而排除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA（OpencircularDNA,简称ocDNA）；若是质粒DNA的两条链在同一处断裂，那么形成线状DNA（LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。三、凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方式。该技术操作简便快速，能够分辨用其它方式（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）染色，在紫外光下至少能够检出1〜10ng的DNA条带，从而能够确信DNA片段在凝胶中的位置。另外，还能够从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。琼脂糖能够制成各类形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通经常使用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一样实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖要紧在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速度由以下多种因素决定:1、DNA的分子大小：线状双链DNA分子在必然浓度琼脂糖凝胶中的迁移速度与DNA分子量对数成反比，分子越大那么所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因此迁移得越慢。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于的DNA片段所需胶浓度是〜％，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为〜％,DNA片段大小间于二者之间那么所需胶浓度为〜％。3、DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，开环DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发觉凝胶上有数条DNA带难以确信是质粒DNA不同构象引发仍是因为含有其他DNA引发时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶别离水解，然后电泳，如在凝胶上显现相同的DNA图谱，那么为同一种DNA。4、电源电压在低电压时，线状DNA片段的迁移速度与所加电压成正比。可是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，片段越大，因场强升高引发的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15%。6、离子强度阻碍电泳缓冲液的组成及其离子强度阻碍DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10X电泳缓冲液），那么电导很高并明显产热，严峻时会引发凝胶熔化或DNA变性。四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之取得新的遗传性状的一种手腕，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的大体实验技术。转化进程所用的受体细胞一样是限制修饰系统缺点的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R，M-),它能够容忍外源DNA分子进入体内并稳固地遗传给后代。受体细胞通过一些特殊方式(如电击法，CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处置后，细胞膜的通透性发生了临时性的改变，成为能许诺外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞显现新的遗传性状。目前经常使用的感受态细胞制备方式有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全能够知足一样实验的要求，制备出的感受态细胞临时不历时，可加入占整体积15%的无菌甘油于〜70℃保留(半年)，因此CaCl2法为利用更普遍。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1、细胞生长状态和密度：不要用通过量次转接或储于4℃的培育菌，最好从-70℃或-20℃甘油保留的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培育液的OD600来操纵。DH5a菌株的OD600为时，密度太高或不足均会阻碍转化效率。2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主若是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在必然范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过量或体积过大时，转化效率就会降低。一样情形下，DNA溶液的体积不该超过感受态细胞体积的5%。3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR或AR),并用超纯水配制，最好分装保留于干燥的冷暗处。4、避免杂菌和杂DNA的污染：整个操作进程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌，且注意避免被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，不然均会阻碍转化效率或杂DNA的转入。五、重组质粒的连接外源DNA片段和质粒载体的连接反映策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化能够产生带有非互补的粘性结尾，这也是最容易克隆的DNA片段，一样情形下，经常使用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因此几乎总能找到与外源DNA片段结尾匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两头人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性结尾用相同的酶或同尾酶处置可取得如此的结尾。由于质粒载体也必需用同一种酶消化，亦取得一样的两个相同粘性结尾，因此在连接反映中外源片段和质粒载体DNA都可能发生自身环化或几个分子串联形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。3、带有平结尾是由产生平结尾的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性结尾要低得多，故在其连接反映中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000)以增进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。六、限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相关于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶那么在对称轴双侧相对的位置上别离切断两条链，产生带有单链突出端(即粘端)的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50”体积1小时内完全切开1ug入噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐利用截然不同的反映条件，乃至对同一种酶也如此。可是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反映条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液(buffer,10X、5X)和最适条件，使得酶切反映变得日趋简单。七、SDS蛋白质电泳细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采纳考马斯亮兰快速染色,可及时观看电泳分离成效。因此依照估量表达蛋白的分子量,可挑选阳性表达的重组体。第二节材料、设备及试剂一、材料不同来源的模板DNA；DH5a菌株：R一，M一，Amp一；BL21Plyst(DE3)F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：购自BeijingTianweiCorporation。本实验所用的特异引物：表2-1设计CrylAc结构域基因特异引物引物序号引物序列15'-CGCGGATCCGGGTGGAGAAAGAATA-3'25'-CGCGTCGACATGTCGATGGGAAGTG-3'35'-CGCGGATCCGGATTGGGTAAGGTAT-3'455'-CGCGGATCCGGTTCGTGTACGGTATG-3'65'-CGCGTCGACTTAGCCCTAGTTGGT-3'7895'-CGCGTCGACTATACCTTACCCAATCTC-3'表2-2CrylAc结构域菌体阳性克隆子的引物引物序列引物名称引物序列T75'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'SP65'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'注：Tm=4(C+G)+2(A+T)二、设备PCR小管；离心管；DNA扩增仪（PE公司或eppendorf）；琼脂糖凝胶电泳所需设备（电泳槽及电泳仪）；台式高速离心机；恒温振荡摇床；高压蒸汽消毒器（灭菌锅）；涡旋振荡器；恒温水浴锅；台式高速离心机；微波炉或电炉；紫外透射仪；数码相机及其附件；电热恒温培育箱；无菌工作台；低温冰箱；制冰机；分光光度计；微量移液枪（20ul,200ul,1000ul）及吸头；电热恒温鼓风干燥箱；蛋白电泳系统ProteawIIBio-Rad；超声波破碎仪；Millipore纯水仪；空气浴振荡器；电子天平。三、试剂：一、限制性内切酶（BamHI,SalI,NdeI）2、10XPCR反映缓冲液3、MgCl2：25mmol/L4、4种dNTP混合物5、TaqDNA聚合酶六、异丙醇7、LB液体培育基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g,酵母提取物（Yeastextract）5g,NaCl10g,溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至，加去离子水至整体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。8、LB固体培育基：液体培育基中每升加13g琼脂粉，高压灭菌。9、氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保留备用。10、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris•Cl（pH8。0）溶液配制成10mg/ml,并分装成小份（如保留于-20℃,每一小份一经利用后便予抛弃。1一、50XTAE（Tris-乙酸）：Tris碱、冰乙酸、5mol/LEDTA10mL加去离子水定容至100mL,利历时用去离子水作50倍稀释,即为工作液。12、溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/,10mmol/LEDTA。溶液I可成批配制，每瓶100ml,高压灭菌15分钟,贮存于4℃冰箱。13、溶液H：mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1%SDS。14、溶液m：5mol/LKAc60ml,冰醋酸，，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac-5mol/L。15、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris•Cl（pH7。5）,15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100c加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用管分装成小份保留于-20℃。正向引物正向引物2|iL16、饱和酚：市售酚17、按体积/体积=1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1：1）。酚和氯仿均有很强的侵蚀性，操作时应戴手套。18、TE缓冲液：10mmo/LTris-Cl,1mmol/LEDTA。高压灭菌后贮存于4℃冰箱中。19、电泳所用试剂：上样缓冲液（6X）：%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。20、溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。2一、1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加XTAE,微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度Dg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液XTAE）,即可上样。2二、含Amp的LB固体培育基：将配好的LB固体培育基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp贮存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。23、连接反映缓冲液（10X）：LTris•Cl,100mol/LMgCl2,100mol/L二硫苏糖醇（DTT）（过滤灭菌），500Dg/ml牛血清清蛋白（组分产品）（可用可不用），10mol/LATP（过滤灭菌）。24、T4DNA连接酶（T4DNAligase）；购买成品。25、IPTG储液（200mg/ml）：在800Dl蒸馏水中溶解200mgIPTG后，用蒸馏水定容至1ml,用Dm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。26、30%储蓄胶溶液：丙烯酰胺（Acr）,亚甲双丙烯酰胺（Bis）,混匀后加ddH2O,37oC溶解，定容至100ml,棕色瓶存于室温。27、Tris-HCl：加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至，定容至100ml。28、1MTris-HCl：加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至，定容至100ml。29、10%SDS：电泳级加ddH2068c助溶，浓盐酸调至pH72,定容至100ml。30、10x电泳缓冲液：，甘氨酸，10%SDS10ml加ddH20溶解，定容至100ml。31、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH20至10ml。32、2xSDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl,0-巯基乙醇，SDS,甘油，％溴酚兰，。33、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰，甲醇200ml,冰醋酸50ml,ddH20250ml。34、脱色液：甲醇50ml,冰醋酸50ml,ddH20400ml。3五、LCaCl2溶液：称取（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,高压灭菌。第三节操作步骤、目的基因的取得：（一）、成立PCR操作程序PCR反映程序PCRPCR反映程序Cry1Ac基因模板2^L

反向引物2|iL反向引物2|iL10xBuffer5^LdNTP4|iLTaqDNA聚合酶1|iL去离子水34|iL总体积50|iLStep194℃3minStep294℃1minStep360℃1minStep472℃2minStep5Gotostep230cyclesStep672℃10min（二）、进行琼脂糖凝胶电泳而且作柱回收DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）一、用干净的刀片将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，尽可能切除多余凝胶。二、加入溶胶液500RL，50℃水浴放置10min。3、将上一步所的溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心30s，倒掉搜集管中的废液。4、加700RL漂洗液，12000r/min离心30s，弃掉废液。五、加500RL漂洗液，12000r/min离心30s，弃掉废液。六、将离心吸附柱放回搜集管中，12000r/min离心2min,尽可能除去漂洗液。7、再将离心柱放在30〜40℃温箱中烘干10min。八、将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间位置加入40gL洗脱缓冲液，室温放置2min,12000r/min离心1min。注意事项紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，利用无DNA污染的新刀片，其目的在于避免外源DNA的污染。（三）、进行目的片段的双酶切：结构域基因的双酶切反映体系目的片段组分目的片段表达载体10|iL表达载体10|iLTOC\o"1-5"\h\z模板DNA10|iL限制性内切酶BamHI2|iL；Sall2|iL缓冲液Tbuffer3|iL去离子水3|iL总体积20^L在此条件下，37℃反映1h。接下来作柱回收。二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的取得：（一）、取菌37℃留宿摇菌提取质粒。一、取培育物倒入离心管中，4℃8000r/min离心1min，重复一次。二、吸去培育液，使细菌沉淀尽可能干燥。3、加入100uL预冷的溶液I,在涡旋混合器上猛烈振荡直至看不见沉淀。4、加入200uL新配制的溶液H,快速倒置离心管5次，以混合内容物，不要振荡，室温3〜5min。五、加入150uL预冷的溶液ffl,温和地振荡混匀，可见白色絮状沉淀，然后放冰上5〜10min。六、加入400uL饱和酚：氯仿（1：1）进行抽提，以除去蛋白质。12000r/min离心5min。7、上清液加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃放置10〜30min。15000r/min离心3min。去上清取得质粒DNA沉淀。八、沉淀用200uL预冷70%的乙醇冲洗沉淀。九、用一小条滤纸警惕吸去管壁残留的上清,将离心管放在超净台中通风干燥,直至无乙醇气味。10、加入适当浓度Rnase的TE缓冲液（或去离子水）重溶质粒DNA,振荡混匀，-20℃备用。（二）进行高效表达载体的双酶切：载体的双酶切反映体系限制性内切酶BamHI2|iL；Sall2|iL限制性内切酶TOC\o"1-5"\h\z缓冲液Tbuffer3|iL去离子水3|iL总体积20^L在此条件下，37℃反映1h。接下来作柱回收。三、pET-21b等与目的片段的连接作用1、在离心管中成立以下连接体系10XT4DNALigaseBuffer2。5|iL目的片段10|iL表达载体2|iLT4DNALigase1|iLdH2Oupto25^L2、16℃留宿反映。四、转化大肠杆菌DH5a进行阳性克隆子挑选与鉴定（一）大肠杆菌感受态细胞制备（DH5a、BL21plyst）注：常规CaCl2法，要求无菌操作。1、从37℃培育的16〜20h的新鲜平板中挑取一个DH5a单菌落，接种于5mLLB培育基中，37℃,180r/min震荡留宿。2、按1%的接种于小三角瓶中，37℃震荡培育3h至OD600为。3、4000r/min离心5min,搜集菌体，倒去上清，加入1/2体积预冷的LCaCl2轻轻悬浮沉淀，置冰上30min。4、4000r/min离心5min,倒去上清，加入1/10体积预冷的LCaCl2轻轻悬浮沉淀。5、进行分装，向每一个离心管中加约200uL的感受态细胞。6、4℃保留备用（一礼拜用完）。（二）连接产物转化1、5uL〜10uL连接产物和200uL感受态细胞在无菌条件下混匀2、冰浴30min3、42℃热击，。4、冰浴2min5、加入500uL〜800uLLB液体培育基（无菌条件下）。6、37℃扩培，180r/min进行60min。7、取100uL〜200uL涂含有氨苄抗性的LB平板。8、放在恒温培育箱中37℃培育留宿。（三）从平板中调取30个菌落编号1〜30,经T7、SP6特异引物进行PCR扩增，来挑选阳性克隆子，最后只需选择一个阳性重组质粒，别离进行单酶切、双酶切及及原始目的片段PCR扩增以确保目的片段真正地连接到表达载体上。CrylAc结构域菌体阳性克隆子的PCR扩增成立以下体系每PCR管分装500gL/30=16pLoPCR反映体系PCR反映程序CrylAc菌体模板少量SP6引物20|iLT7引物20|iL10xBuffer50|iLStep194℃5mindNTP(10mmol/L)10uLStep294℃1minTaqDNA聚合酶5^LStep352℃1min去离子水400|iL总体积500|iLStep472℃2minStep5Gotostep230cycles当载体上T7、，SP6特异引物P调后，应在原目Step672℃10min的片段基础上加约200bp长度，再通过琼脂糖凝胶电泳应取得取得咱们所要的重组DNA。挑选出阳性克隆子进行质粒提取及单、双酶切五、转化转化大肠杆菌BL21plyst,摇菌进行SDS电泳。（一）CrylAc结构域基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达1、将阳性克隆子别离进行质粒提取，再别离转化大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21Plyst表达菌株,涂平板,37℃培育留宿。二、菌种活化：5mL培育基的试管中各加入氨苄，摇匀。用10uL无菌枪头挑取单菌落，接种。放入到摇床中，180r/min,37℃,振荡培育12h。掏出活化好的菌种。先在100mL的培育基中滴入氨苄，摇匀。按1%的量接种，放到摇床中，230r/min,37℃,振荡培育2h~3h。3、融合蛋白的诱导表达：向菌液中别离加入终浓度L的IPTG作诱导剂。28℃，180r/min，振荡培育8h。取以上诱导培育液，倒入离心管中，5000r/min，4℃离心10min。弃去上清，加入5mL10mmoL/L的Tris-HCl（），悬浮沉淀，加入适当浓度的溶菌酶进行破壁处置，4℃12000r/min离心