兽医现代监测诊断技术终稿

兽医现代监测诊断技术

张东

四川省动物疫病预防控制中心研究员兽医监测诊断技术在动物疫病防控和兽医公共卫生工作中具有重要作用，是预防、控制和扑灭重大动物疫病中的重要一环，为养殖业健康发展和公共卫生安全提供保障。前言提纲面临的复杂形势

动物疫病诊断技术现状

检测技术发展方向与未来展望

1面临的复杂形势

动物疫病种类多

农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中列入157种；其中一类17种；二类77种；三类63种。OIE《陆生动物卫生法典》2010版中列入94种；包括多种动物共患病26种；牛病14种；绵羊和山羊病11种；马病11种；猪病8种；禽病14种；兔病2种；蜂病6种；其他疫病2种。新发动物疫病威胁国外威胁：非洲猪瘟（俄罗斯）等；周边省威胁：小反刍兽疫（西藏）、

口蹄疫A型（2008年湖北）等；新发亚型：口蹄疫亚洲I型（2005年出现）等。动物疫病病原型别多、变异快口蹄疫：7个型，多个亚型；我国O型、亚洲I型（2005年4月传入中国）、A型流感：A、B、C3个型；A型：H1~H16亚型；H5亚型：变异株不断出现……疫苗：-1、-4、-5株……PRRS：1996年美洲型；2006年变异株；2009年欧洲型1株。另外，还有小反刍兽疫（西藏）、疯牛病、非洲猪瘟、尼帕病……等外来重大疫病的威胁2010年列入国家监测计划的动物疫病（16种）高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性蓝耳病、猪瘟鸡新城疫、布鲁菌病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病牛海绵状脑病、痒病、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、非洲猪瘟、蓝舌病国家强制免疫动物疫病外来动物疫病主要疫病的国家指定监测方法病名指定诊断方法口蹄疫正向间接血凝试验、液相阻断ELISAVP1-ELISA高致病性禽流感血凝抑制试验（HI）猪瘟正向间接血凝试验、阻断ELISA高致病性猪蓝耳病ELISA、鸡新城疫血凝抑制试验（HI）布鲁菌病虎红平板试验、试管凝集试验血吸虫病斑点ELISA、免疫金标快速试纸条牛结核病结核菌素变态反应试验地市级、县级实验室的适用试验技术县级实验室地市级实验室凝集试验（高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟、新城疫等病）；ELISA（猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等病）县级实验室开展的试验技术RT-PCR技术（猪瘟，PRRS等病）省内诊断断试剂使使用的现现状主要诊断断试剂提供单位位有：兰州兽医医研究所所哈尔滨兽兽医研究究所猪瘟和口口蹄疫O型正向间间接血凝凝；口蹄疫ＡＡ型、Asia—I和O型液相阻阻断ELISA；3ABC-ELISA，VP1-ELISA；猪圆环病病毒ELISA；禽流感H5血凝抑制抗抗原；鸡新城疫疫血凝抑抑制抗原原；其他：猪蓝耳病病ELISA———法国进口口；猪伪狂犬犬、猪细细小病毒毒ELISA———荷兰赛迪迪诊断公公司；猪蓝耳病病RT-PCR，猪乙型型脑炎RT-PCR，猪细小病病毒PCR等——北京爱德德士元亨亨生物技技术有限限公司。。疫苗种类类各异、、诊断试试剂和方方法多样样以口蹄疫疫为例抗体检测测试剂品品种病原检测测试剂品品种正向间接接血凝琼脂凝胶胶免疫扩扩散试剂剂液相阻断断ELISA试剂盒非结构蛋蛋白ELISA试剂盒(3ABC)结构蛋白白ELISA试剂盒（（VP1）免疫胶体体金试剂剂盒（测测抗体））RT-PCR试剂盒荧光RT-PCR试剂盒ELISA试剂盒免疫胶体体金试剂剂盒（测测抗原））反向间接接血凝试试剂国内动物物疫病诊诊断试剂剂存在的的主要问问题技术方法法：标准准?各企业生生产诊断断试剂的的的标准准不一。。诊断试剂剂：文号号？302个产品中中，有新新兽药证证书产品品7.6%，有生产产批准文文号产品品4.3%，列入标标准产品品7%。法规管理理：完善善？市场秩序序混乱：：国内生生产企业业不具有有资质、、产品无无新兽药药证书或或批准文文号、国外生产产企业注注册生产产的产品品进入国国内未经经注册、、非法生生产产品品产品质量量：不齐齐？1.质量水平平低，试试验特异异性不高高，产品品保质期期短；2.适用范围围窄，操操作复杂杂；3.生产能力力小，购购买难；；4.检测目的的不明确确（型/亚型、感感染/免疫抗体体等）。。国外动物物疫病诊诊断试剂剂进口兽用用诊断试试剂质量量好，但但是成本本高、购购买周期期长，有有的不适适合中国国的实际际情况。。国内兽用用诊断试试剂问题题之根源源行业特点点产品种类类多，成成分复杂杂，生命命周期长长，技术术含量高高，质量量要求严严格，单单位用量量小投入资金金巨大，，产品开开发周期期长监管措施施不完善善研发：基基础研究究、高科科技研究究投入力力度小，，科研与与生产脱脱节。生产、经经营：企企业规模模小、效效率低、、利润低低，发展展不均衡衡，且部部分没有有生产资资质；诊诊断试剂剂注册审审批程序序繁琐，，进入市市场门槛槛高。使用：盲盲目选择择诊断试试剂，采采购、验验收、保保藏制度度不健全全。产业化和和商品化化发展滞滞后，非非法诊断断试剂产产品市场场占有比比例大。。动物疫病病诊断试试剂行业业发展建建议先进的产产学研模模式，提提高自主主创新能能力，建建设科研研院所和和企业的的产业链链严格市场场准入完善的质质量监控控体系，，进行规规范化、、标准化化管理达到扩充充兽用诊诊断试剂剂种类，，提高产产品质量量，满足足动物疫疫病监测测、诊断断工作需需要2动物疫病诊断断技术现状常用实验室检检测技术组织病理学检检测技术血清学检测技技术分子生物学检检测技术病原学检测技技术组织病理学检检测技术1.病理学检测技技术是利用疫病引引起的动物组组织发生特征征性的病变和和病理变化对对动物疫病进进行诊断。2.免疫病理学检检测技术(免疫组织化学学技术)免疫组织化学学方法不仅可可在脏器组织织中特异地检检出病原,又可发挥病理理学检测所具具有直观、抗抗原定位准确确的特点,还可在脏器组组织原位检测测出病原（原原位PCR）的同时，观观察到组织病病变与该病原原的关系，从从而有助于了了解疫病的发发病机理和病病理过程。血清学检测技技术按其反应性质质的不同可分分为：凝集性反应(如凝集试验和和沉淀试验)标记抗体技术术(包括荧光抗体体、酶标抗体体、放射性标标记抗体等特点：敏感、快速（（ELISA只需要1~2小时）。补体参与的反反应(补体结合试验验、免疫粘附附血凝试验等等)。中和试验(病毒中和试验验和毒素中和和试验)特点：时间长，约需需要18小时才能获得得结果。免疫转印技术术。正向间接血凝凝诊断技术特点：正向间接血凝凝为一种微量量的定量反应应试验，其应应用广泛，其其无需昂贵的的设备，操作作简单，并且且有快速、敏敏感、特异性性。操作要点及注注意事项：A.试验准备：采集3只以上未免疫疫鸡全血混合合制红细胞悬悬液；选用孔底应光光洁透明无可可见沉淀附着着物的反应板板(一次性的最好好)；待检血清要新新鲜，未腐败败、溶血，无无悬浮物。B.操作过程：尽可能的保证证样品被全部部加入反应孔孔；每次滴加加抗原前应充充分摇匀，从从稀释度高的的孔开始加起起，并避免滴滴头和孔内的的液体直接接接触；避免稀稀释时孔内产产生气泡，直直接影响结果果判定。C.结果判定：正确识别“++”的凝集现象。。待检样品2待检样品1阳性对照阴性对照正向间接血凝凝反应原理图图间接血凝抑制制反应原理示示意图红细胞间接血凝反应原理示意图抗体致敏红细胞联免疫吸附试试验（ELISA）具有灵敏度高、特特异性强、快快速、简便、、重复性好、、安全、适合合大批量标准准化检测的特点。是当前应用最最广、发展最最快的一项新新技术，目前前该方法已被被广泛用于多多种细菌和病病毒等疾病的的诊断。其基本过程是是将抗原(或抗体)吸附于固相载载体，在载体体上进行免疫疫酶反应，底底物显色后用用分光光度计计或酶标仪判判定结果。其可分为以下下几种方法：：原理及分类常用的直接法法ELISA（测抗体）分子生物学检检测技术用于动物疫病病特异性快速速诊断和病原原基因变异与与进化分析，，及时准确掌掌握动物疫病病分子流行病病学动态，为为疫病防治提提供基因理论论分析依据。。核酸探针技术术、基因序列列分析比如基因芯片片试剂盒。聚合酶链反应应（PCR）（应用最广）疫病的早期诊诊断和不完整整病原的检测测快速、准确、、安全的检测测病原体在病原体分类类和鉴别中的的应用PCR仪基因芯片仪聚合酶链式反反应（PCR)是以DNA变性、复制的的某些特性为为原理设计的的。通过PCR技术获取病原原微生物的特特异DNA片段，从而为为疾病诊断提提供重要依据据。特点：快速；；敏感；步骤较多。PCR反应原理图反转录PCR技术即RT-PCR技术。用于检检测RNA病毒。首先提取总RNA，然后加入引引物在反转录录酶的作用下下合成cDNA，加热变性成成为单链cDNA后，加入与之之互补的另一一引物，进行行PCR反应。分为一步法和和两步法两种种RTRT-PCR反应原理图多重PCR技术(Multi-PCR）它是一种特殊殊的PCR形形式，其最突突出的特点是是一次PCR反应．在同同一反应体系系中同时加入入多对不同PCR引物和和相应的模板板，可同时检检测、鉴别出出多种病原体体，在临床混合合感染的鉴鉴别诊断上上具有其独独特优势和和很高的实实用价值。病原学检测测技术1.细菌的分离离与鉴定2.病毒的分离离与鉴定是病毒毒性疫疫病检检测、、诊断断、流流行病病学调调查和和未知知新病病毒进进行分分类鉴鉴定的的重要要方法法之一一。如如，此此法称称为检检测口口蹄疫疫的黄黄金标标准。。但是是对实实验室室能力力要求求较高高，且且耗时时长。。3.寄生虫虫检测测寄生虫虫病诊诊断中中其定定性的的实质质性方方法有有以下下几种种:虫卵检检查法法、虫虫体检检查法法、免免疫学学检查查法和和分子子生物物学检检查法法。诊断新新技术术及应应用我国免免疫预预防为为主的的动物物防疫疫政策策，决决定了了在现现实的的动物物疫病病监测测工作作中，，迫切切需要要实用用的对对动物物疫病病病原原的快速诊诊断技技术以及能能区分免免疫动动物和和自然然感染染动物物的鉴鉴别诊诊断技技术。目前国国内符符合上上述要要求的的诊断断新技技术主主要有有以下下3种:1.免疫胶胶体金金快速速诊断断试纸纸条2.荧光PCR3.鉴别诊诊断技技术4.原位PCR技术免疫胶胶体金金快速速诊断断试纸纸条特点：：操作简简易，，速度度快快快，10分钟内内出结结果，，方便便基层层开展展工作作目前已已经有有了口口蹄疫疫、猪猪瘟、、禽流流感、、血吸吸虫等等病的的胶体体金快快速诊诊断试试纸条条。技术原原理：：试纸条的正面和侧面免疫层层析快速检测试试纸结结构及及原理实时荧荧光定定量PCR与普通通PCR相比：：1.自动化化程度度高，，极短短的检检测时时间（没有有了制制胶和和PCR产物电电泳步步骤，，快速速热循循环仪仪也缩缩减了了运行行时间间，在在30分钟内内可以以得到到完美美的实实验结结果））；；2.敏感性为普普通PCR的100倍；3.直观的软件件分析；4.有效解决PCR污染问题；；5.安全性更好好。6.不足：资金投入大大，检测成本高高。实时荧光定量PCR反应软件分析截图实时荧光定量PCR仪鉴别诊断技技术鉴别诊断技技术的重要要性：A：区分自然然感染抗体体和疫苗免免疫抗体的的鉴别诊断断技术；B：从普遍免免疫的动物物群体中甄甄别出自然然感染和带带毒的动物物。该项技术的的核心是基基因工程技技术、单克隆抗体体技术与诊断技术术的综合运运用，其科科技水平高高，研究的的难度叶较较大。单克隆抗体体技术目前市场上上已有部分分利用单克克隆抗体制制备的金标标快速检测测卡和ELISA试剂盒（（比如猪瘟瘟）。原位PCR———分子病理学学新技术是一种将PCR技术与原位位杂交技术术结合起来来的可以检检测组织细细胞中微量量DNA或RNA且可精确定定位的新技技术。特点：敏感度更高高，优于免免疫组化技技术。目前应用情情况：主要要用于病毒毒检测，也也有检测组组织中寄生生虫感染的的报道。3检测技术发发展方向与与未来展望望血清学检测测技术发展展方向简单、快速速便于普及及的快速诊诊断技术以胶体金标标记技术为为代表，操操作简单、、快捷，实实现现地现现用。高度集成、、自动化的的仪器诊断断技术以ELISA（全自动酶酶免工作站站）为代表表，可实现现大规模操操作，且灵灵敏度高、、特异性强强。分子检测技技术的发展展方向自动化利用全自动动仪器完成成核酸提取取、反应液液配制、上上机反应和和结果分析析的所有步步骤多功能新型型生物液体体处理工作作站：可以以一机实现现DNA/RNA提取和PCR反应建立实时荧光定定量PCR仪：可以一一机实现上上机反应和和结果分析析高通量在提高灵敏敏度和特异异性的基础础上，实现现一次检测测分析所有有常见疫病病和对一种种疫病分型型的目的。。检测和核酸酸序列分析析的综合随着测序仪仪器设备的的完善，将将检测与序序列分析结结合的诊断断技术将逐逐步应用于于临床。分子检测技技术的发展展方向结束语正确的制定定动物疫病病监测方案案，合理的的综合选择择实用的诊诊断技术，，可以帮助助养殖企业业制定科学学的动物疫疫病防治策策略和计划划，建立有有效的净化化措施，提提高生产质质量和经济济效益，以以保障畜牧牧业快速、、健康、持持续发展，，保障公共共卫生事业业，保护人人民身体健健康。谢谢谢！9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。1月-231月-23Saturday,January7,202310、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。19:25:0219:25:0219:251/7/20237:25:02PM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。1月月-2319:25:0219:25Jan-2307-Jan-2312、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。19:25:0219:25:0219:25Saturday,January7,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2319:25:0219:25:02January7,202314、他乡生白发发，旧国见青青山。。07一月20237:25:02下午19:25:021月-2315、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。一月237:25下下午1月-2319:25January7,202316、行动出出成果，，工作出出财富。。。2023/1/719:25:0219:25:0207January202317、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。7:25:02下下午7:25下下午19:25:021月-239、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。1月-231月-23Saturday,January7,202310、很多多事情情努力力了未未必有有结果果，但但是不不努力力却什什么改改变也也没有有。。。19:25:0219:25:0219:251/7/20237:25:02PM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。1月-2319:25:0219:25Jan-2307-Jan-2312、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留留一一份份不不足足，，可可得得无无限限完完美美。。。。19:25:0219:25:0219:25Saturday,January7,202313、不知香积寺寺，数里入云云峰。。1月-231月-2319:25:0219:25:02January7,202314、意志坚坚强的人人能把世世界放在在手中像像泥块一一样任意意揉捏。。07一一月20237:25:03下午午19:25:031月-2315、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荆荆门门九九派派通通。。。。。一月月237:25下下午午1月月-2319:25January7,202316、少年十十五二十十时，步步行夺得得胡马骑骑。。2023/1/719:25:0319:25:0307January202317、空山新雨雨后，天气气晚来秋。。。7