第一篇细胞周期效应

第一篇细胞周期效应第二篇细胞的剂量率效应一.细胞的增殖方式二.细胞的增殖周期三.细胞的放射敏感性细胞增殖方式细胞的增殖就是通过细胞分裂增加细胞数量。方式有以下三种：无丝分裂（amitosis）有丝分裂（mitosis）减数分裂（meiosis）意义：生物体生长发育繁殖和遗传的基础1.无丝分裂（amitosis）因为分裂时没有纺锤丝与染色体的变化，所以叫做无丝分裂，又因为这种分裂方式是细胞核和细胞质的直接分裂，所以又叫做直接分裂。无丝分裂的方式有二分裂，多核分裂和出芽分裂。其中最主要的是二分裂，即细胞核先延长，从核的中部向内凹进，缢裂成为两个细胞核；接着，整个细胞从中部缢裂成两部分，形成两个子细胞。人体中常见的有肝细胞，肾小管上皮细胞和口腔上皮细胞等高度分化的细胞。2.有丝分裂（mitosis）

又称间接分裂(indirectdivision)，是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于动物和高等植物。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。3.减数分裂（meiosis）是指生殖细胞中染色体数目减半的分裂方式。生殖细胞分裂时，染色体只复制一次，细胞连续分裂两次，染色体数目减半的一种特殊分裂方式。二.细胞周期（cellcycle）

（G1-->S-->G2-->M）细胞周期(cellcycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，分为细胞间期与分裂期两个阶段。细胞周期

分裂间期分裂期（M期）G1期

DNA合成前期S期

DNA合成期G2期

DNA合成后期前期中期后期末期不同细胞种类的细胞周期

从上图中我们可以看到不同生物、不同组织，以及机体发育的不同阶段，细胞周期时间差异较大；但仍表现有相似之处,如G1期最长，S期较长,M期短；其中,细胞周期时间长短主要差别在G1期。1.G1期（DNA合成前期）

时期：子细胞继续增长时期。时间：变化大特点：细胞生长的主要阶段合成各种物质，能对周围的环境信号综合，协调，做出反应确定是否进入S期。时间长度变异大：人体200多种细胞，周期时间不同，主要在G1如：胚胎早起卵裂细胞几乎测不到淋巴细胞数小时神经元细胞终生停在G1期

G1期决定了不同细胞细胞周期的长短，是因为G1期内存在一个校正点或阻止点（简称R点）。R点要判断：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？通过了此点，细胞就能以正常速度不受外界条件的影响而完成细胞周期的其他时期。因此，有人认为细胞的生长是在G1期R点上停止的。由于R点的限制作用，G1期有三种不同增殖状态:①继续增殖细胞:如造血干细胞、睾丸精原细胞、消化道黏膜细胞、胚胎早期细胞。②暂不增殖细胞：如肝、肾、胰的实质性细胞、结缔组织中的成纤维细胞、血液中的淋巴细胞等都属此类细胞。③不再增殖细胞：如多形性白细胞、角质细胞、神经元细胞、骨骼肌细胞、成熟红细胞等.继续增殖细胞：始终保持旺盛的分裂活性，对外界环境信号敏感，分化程度低，周期时间稳定。暂不增殖细胞：G1期合成具有特殊功能的RNA和蛋白质，使细胞结构和功能发生分化，一般情况下，不进行分裂，处于G0期，在适当条件下如组织受到损伤或淋巴细胞接受植物凝集素的刺激以后，可以恢复增殖状态。不再增殖细胞：结构和功能高度分化，丧失增殖能力，这些细胞终身处于G0期，通过衰老→死亡。2、S期时期：DNA合成时期特点：为分裂做准备，DNA复制开始时，急剧形成DNA聚合酶及四种脱氧核苷酸后，DNA加倍。DNA复制是增殖的基础，完成复制才能进入M期。DNA合成时期是遗传物质容易突变的时期时间：10h左右3.G2期时期：DNA合成后期，分裂之前特点：继续合成与分裂有关的蛋白质，尤其是细胞骨架重新组装蛋白质，如组织蛋白的合成细胞就不进入分裂期。此期DNA已加倍，染色质开始螺旋但程度轻。时间：较短，约2~3h4、M期时期：有丝分裂时期，也是细胞周期的最终阶段。特点：形态、结构变化最大，细胞增殖标志。时间：短，较恒定分期：前、中、后、末

前期：染色质凝集，核膜消失20~30min

中期：染色体排列在赤道板上20~30min

后期：姊妹染色单体分离5~7min

末期：细胞质分裂，形成两个子细胞20~30min

肿瘤细胞的周期特点肿瘤细胞有三个显著的基本特征即：不死性，迁移性和失去接触抑制。肿瘤细胞之所以有高的生长率是因为：1.参与增殖的后裔细胞数量多。2.G0期持续时间短（称为G0i期），无细胞分化，终必进入G1期。肿瘤细胞周期失控，不受正常调控系统的控制，能持续分裂和增殖。细胞周期检验点（checkpoint）

细胞周期中的每一期都是为下一期作准备，从而使子代细胞获得相同的遗传物质。因此，细胞都要在进入下一期之前进行检查，称为检验点。它们的作用是细胞遇到环境压力或DNA受到损伤时使细胞周期停止的“刹车”作用。假如检验点的功能失灵就可以导致癌的形成。以G1/S和G2/M最为重要。

四个检验点（checkpoint）G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会引起细胞周期中断。三.细胞的放射敏感性是指一切照射条件完全一致时，机体器官和组织对辐射反应的强、弱和速度快慢情况。若反应强、速度快其放射敏感性就高；反之则低。主要与以下几个因素有关：1.细胞分化程度：分化越高，放射敏感性越低，反之，则放射敏感性越高；2.细胞增殖能力越强，放射敏感性越高；3.细胞周期的分布：以对细胞增殖性致死而言，细胞周期放射敏感性不同。细胞周期时相和放射敏感性放射敏感性与细胞周期的关系可以用同步化细胞群来研究。同步化(synchronization)培养物中所有的细胞都处于细胞周期的相同阶段，称为细胞的同步化。细胞同步化分自然同步化和人工同步化。‍自然同步化有丝分裂法细胞周期同步化选择同步化密度梯度离心法人工同步化分裂中期阻断法诱导同步化DNA合成阻断法了解同步化的方法自然同步化自然界中已经存在一些细胞群处于细胞周期的同一时相细胞周期同步化。在动、植物及粘菌中都有所发现，如有一种黏菌的变形体plasmodia，某些受精卵早期卵裂它们不受人为条件的干扰，因而有可能在接近自然的条件下进行观察。缺点：自然同步化受到很多条件的限制。1.有丝分裂选择法对数期的培养细胞——细胞分裂活跃贴培养皿壁生长且该期细胞变得圆隆与壁附着性低——震荡使细胞脱落悬浮到培养液中——收集培养液离心——获得分裂期细胞。重新培养获得不同时相的细胞优点：细胞未经过任何药物处理，能真实反应细胞周期状况，细胞同步化效率高。缺点:分离的细胞数量少。2.密度梯度离心法根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离，得到处于不同时期的细胞。优点：方法简单省时，效率高，成本低缺点：对大多数种类细胞并不适用3.DNA合成阻断法——G1/S-TdR双阻断发在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR（胸腺嘧啶核酸）。S期细胞被抑制，其它细胞继续运转，最后停在G1/S交界处。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积增大。4.分裂中期阻断法通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂期的合成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点：操作简单，效率高。缺点：这些药物的毒性相对较大，如果处理时间过长，所得到的细胞常常不能恢复正常周期运转。在实际工作中常常几种方法并用，以获得数量多、同步效率高的细胞。※同步化细胞群的放射反应在体外细胞研究中，细胞群经同步化以后，发现经照射以后细胞周期中不同时相的细胞的放射敏感性有很大差异。M期细胞对射线最敏感，其次是G2期细胞、G1期细胞(G1后期要比早期敏感)、早S期细胞，晚S期细胞是最不感的。四.细胞周期效应在临床中的应用我们希望肿瘤组织经处理后使其全处于放射敏感的时相，虽然实际上很难做到这一点，但在临床上使用分次放射方法可使各阶段细胞尽可能靠近。分次放射治疗的理论基础也就是主要的生物学因素：1.放射敏感性（radiosensitivity）

2.修复（repair）3.再氧合（Reoxygenation）4.再分布（Redistribution）4"R"5.再群体化（Repopulation）1.修复(Repair)受到致死损伤的细胞将发生死亡，而射线引起的所谓亚致死损伤及潜在致死损伤的细胞，在给予足够时间、能量及营养的情况下，可以得到修复生存下来。2，再氧合（Reoxygenation）也称为乏氧细胞的再氧化富氧细胞对放疗比较敏感，较易被放射线杀死，乏氧细胞对放疗耐受性较强，不易被杀灭。肿瘤组织常有供血不足及乏氧细胞比率高的问题，部分癌细胞可逃避放射损伤，这是放疗后肿瘤再生长及复发的常见原因之一。放疗中，富氧细胞被杀灭，原来乏氧的细胞可能获得再氧合的机会，从而对放疗的敏感性增加。3，再分布(Redistribution)癌细胞群的细胞常处于不同的细胞增殖周期中，对射线敏感也不一致。最敏感的是M期细胞，G2期细胞对射线的敏感性接近M期，S期细胞对射线敏感性最差。对于G1期的细胞来讲，G1早期对射线的敏感性差，但G1晚期则较敏感。对放疗敏感的细胞被清除，引起癌细胞群中细胞周期再分布，使不敏感细胞转化为较敏感细胞。4.再群体化（Repopulation）也称再增殖，放疗后细胞分裂将加快，肿瘤组织生长也比较快。考虑细胞有再增生作用，放疗需要延长疗程，增加总照射量，才能达到更满意的治疗效果。分次放射与细胞周期分次放疗对于细胞周期不同时期的细胞个数（细胞密度）的变化有5个因素：1、射线对细胞的杀灭效应，导致细胞密度的减小2、分次放射是各期细胞向前进程速度减慢，导致细胞密度的增大。3、各时相细胞的放射敏感性的差异4、处于该时相的细胞进入下一时相使该时相的细胞密度下降。5、上一时相的细胞进入该时相使细胞密度增大放疗后各时相细胞进入下一时相的速度有差异，G2进入M期的速度最慢，S期进入G2期次之.G1后期上升阶段照射后DNA损伤使P53基因激活，其蛋白产物P53蛋白作为转录因子使其下游靶基因P21,GADD45和MDM2转录，并表达P21，GADD45和MDM2蛋白。P21蛋白作为周期素依赖性激酶抑制剂，抑制cyclinD-cdk4和cyclinD-cdk6活性，使PRb蛋白仍处于去磷化，E2F因子仍与PRb结合，不能发挥其转录因子作用，使依赖于E2F因子调控的基因不能转录，阻止细胞进入S期，从而减慢G1到S期的速度。对于G2期的“细胞堆积”（自增敏）：虽然G2的放射敏感性很大，但是放疗后对G2期的阻滞作用更明显。G2-M的速度最慢，细胞大部分被阻滞在这个时期，所以G2期的细胞密度很大。这对于临床治疗有重要意义，可以通过分割放射使各期细胞同步到敏感期G2期。辐射及其他损伤因子作用后多种细胞会发生G2阻滞，但各种情况下其分子调控的细节尚有区别，但最终均是导致MPF失活，阻止细胞进入有丝分裂期。分次照射使敏感的M期等期相细胞杀灭，其他各期细胞向前进程的速度减慢（分裂延缓），其中以G2减慢速度最为显著，有可能使较多的细胞同时进入敏感期，导致细胞群的自我增敏。如何定分次剂量?根据L-Q模型,相交点的剂量：低于这个交点剂量，晚反应组织的损伤较肿瘤（早反应组织）的小；高于这个交点剂量，晚反应组织的损伤较肿瘤（早反应组织）的大。这就为分次剂量的制定提供了一个理论依据。

当然，我们的目的是最大限度的杀灭肿瘤组织并最大限度的保护正常组织，那么最佳剂量可能位于两组织的细胞存活曲线相距最大位置，该剂量一般为交点剂量的50%。因为D交在2~5Gy，常规分次的最佳剂量应位于1~2.5Gy的范围。

假设次间间隔时间够长，让亚致死损伤的细胞得以完全修复，再次照射时将得到同样形状的细胞存活曲线。当分次剂量低于两种曲线的交点时，由于晚反应组织的存活曲线比早反应组织的更加弯曲，分次照射的结果是肿瘤组织的损伤大于晚反应组织的损伤，对晚反应组织有更多的保护，分次越小其存活曲线越平坦，保护作用越大。当分次剂量高于D交，结果是晚反应组织的损伤大于早反应组织的损伤，应该予以避免的分次方案。第二篇剂量率效应定义：随辐射剂量率的改变，其生物效应也发生相应改变的现象。总剂量一定时，剂量率越低，照射时间越长，生物效应就越减轻。其机制是在拖延照射的过程中发生亚致死损伤的修复和细胞的增殖。就X射线和γ射线来说，剂量率是决定于个特定的吸收剂量的生物学后果的主要因素之一。目前剂量率可分为四大范围：（1）超高剂量率：用μs或ns计算脉冲的照射，在109--12Gy/min的剂量范围内，主要用于科研。（2）高剂量率（HDR）：1--10Gy/min，是目前一般放疗外照射所用剂量。（3）低剂量率(LDR)：在放疗中用几个小时或几天的延续照射。0.1--1Gy/h，常用于腔内或组织间的照射。（4）非常低剂量率：用以放射生物实验研究，时间可长达几周、几个月甚至几年。剂量率效应的概述

图中实线表示一次照射的存活曲线，另外两条为分次照射的存活曲线。若将总剂量分割，分次照射2Gy或4Gy，则在每一次分割照射后都会出现一个肩部。当总剂量相同时，由于细胞亚致死性损伤的修复，分次照射的存活分数显著提高，而且分次越高提高越明显。例如，当总剂量为20Gy时，一次照射的存活分数为4.8x10-7（点1），5x4Gy照射后的存活分数为10-5（点2），而10x2Gy照射后的存活分数为9x10-4（点3），点3是点2存活分数的90倍。当总剂量为12Gy时，一次照射的存活分数为2.2x10-4（点4），3x4Gy照射后的存活分数为10-3（点5），而6x2Gy照射后的存活分数为1.5x10-2（点6），点6是点5存活分数的15倍。。鉴于连续低剂量率可被认为是无数的无穷小分次，在这种情况下可预期连续低剂量率的存活曲线是没有肩且比一次急性照射的曲线较为平坦。1.剂量率效应举例上图综合了很宽的剂量率照射离体培养Hela细胞(人宫颈癌上皮细胞)后的存活曲线。随着剂量率的降低，存活曲线也趋向于较为平坦，肩也逐渐消失；因亚致死损伤所致的剂量率效应在0.01-1Gy/min之间的变化最为明显；大于和小于这剂量率范围，存活曲线基本不因剂量率的改变而变化。中国仓鼠细胞，也表现出较大的剂量率效应。下图可见至少在剂量率1.07Gy/min、0.3Gy/min和0.16Gy/min的高剂量时，其生物效应有显著差别，而当剂量率进一步下降时，细胞杀灭作用明显下降。

从上面两图比较，Hela细胞有较小的肩，而其剂量率效应也较轻；中国仓鼠细胞有较宽的肩，并表现出较大的剂量率效应，说明不同细胞类型的剂量率效应有很大的区别；反映了细胞积聚和修复亚致死损伤的能力的不同。

下图显示了来自人体的40种不同的离体培养细胞系接受低剂量率照射的存活曲线呈扇形分布，其斜率有较大的差异。因为，有些细胞系修复亚致死损伤很快，有些较慢，这在低剂量率的存活曲线内能反映出来。2.反向剂量率效应theinversedoserateeffect

是指当剂量率降低时细胞杀灭反而增高右图所示，对细胞系照射的剂量率从1.54Gy/h

降至0.37Gy/h，提高了灭杀细胞的效应.研究证实，高剂量率（HDR）照射下的细胞存活曲线都有明显的肩区，随着剂量的降低和照射时间的延长，越来越多的亚致死性损伤（SLD）在照射期间得到修复，肩区也趋于消失。当所有SLD都被修复时就达到了一个极限斜率，继续降低剂量率照射，细胞死亡反而明显增加，这时存活曲线又变得陡峭起来，产生所谓的“反剂量率效应”。反剂量率效应产生的原因：有关反剂量率效应产生的具体机制至今还是很有争议的。以下是部分文献提到的相关解释。解释1：与G2阻滞（放射增敏）有关。解释2：与“细胞雷达”（DNA损伤传感器）有关。反剂量率效应示意图解释1：与G2阻滞（放射增敏）有关

持续低剂量照射导致细胞聚集于G2期，细胞周期不再进展，分裂停滞，即产生G2阻滞。由于G2期是对辐射很敏感的时期，结果导致高的细胞致死性。在LDR持续照射下，不但影响细胞周期再分布，产生G2阻滞，也抑制了辐射损伤修复。

这种解释可以说明LDR相对于HDR更高的杀灭效应，但不能解释为什么剂量率越低，杀灭效应越显著。有学者认为反剂量率效应效应与细胞周期再分布无直接关系，并且G2阻滞并不一定能引起辐射敏感性的增高。解释2：与“细胞雷达”（DNA损伤传感器）有关

现已证明，辐射可以引起多种类型DNA损伤，包括单链断裂(singlestrandbreaks,SSB)、双链断裂(doublestrandbreaks,DSB)、碱基损伤和DNA蛋白交叉连接。目前认为，DNADSB是最重要的损伤，最终可导致细胞死亡、染色体失常以及细胞恶性变。细胞内存在一种探测机制，对DNA损伤修复起关键作用，称之为“细胞雷达”(cellularradar)。当DNADSB数量达到一定阈值就会被DNA损伤传感器探测到，从而启动细胞的修复机制。反剂量率效应是在一定剂量率阈值以下照射引起的DNADSB数量不能被修复机制探测到而导致的。随着剂量率的降低，DNADSB的数量也会减少，当剂量率降低到一个阈值后，DNADSB数量就少到不足以被DNA