仪器教程高效液相色谱法

高效液相色谱法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

20-1概述

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法

高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1.例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.2．高效液相色谱法与气相色谱法

（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。20-2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的结构示意见图20-1，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

1．高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。2．进样系统

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

3分离系系统——色色谱柱色谱柱是液液相色谱的的心脏部件，它包括柱柱管与固定定相两部分分。柱管材材料有玻璃璃、不锈钢钢、铝、铜铜及内衬光光滑的聚合合材料的其其他金属。。玻璃管耐耐压有限，，故金属管管用得较多多。一般色色谱柱长5～30cm，内径径为4～5mm，凝凝胶色谱柱柱内径3～～12mm，制备往往内径较大大，可达25mm以以上。一般在分离离前备有一一个前置柱柱，前置柱柱内填充物物和分离柱柱完全一样样，这样可可使淋洗溶溶剂由于经经过前置柱柱为其中的的固定相饱饱和，使它它在流过分分离柱时不不再洗脱其其中固定相相，保证分分离技的性性能不受影影响。柱子装填得得好坏对柱柱效影响很很大。对于于细粒度的的填料（＜＜20μm）一般采采用匀浆填充法法装柱，先将填料料调成匀浆浆，然后在在高压泵作作用下，快快速将其压压入装有洗洗脱液的色色谱柱内，，经冲洗后后，即可备备用。4．检测系系统在液相色谱谱中，有两两种基本类类型的检测测器。一类类是溶质性检测测器，它仅对被被分离组分分的物理或或化学特性性有响应，，属于这类类检测器的的有紫外、荧光光、电化学学检测器等等。另一类是是总体检测器器，它对试样样和洗脱液液总的物理理或化学性性质有响应应，属于这这类检测器器的有示差折光，，电导检测测器等。现将将常用的检检测器介绍绍如下:（l）紫外外检测器（2）荧光光检测器(3)示示差折折光率检测测器几乎所有物物质都有各各自不同的的折射率，，因此差示示折光检测测器是一种种通用型检检测器。灵灵敏度可达达10-7g·cm-3。主要缺点点是对温度度变化敏感感，并且不不能用于梯梯度淋洗。。（4）电导导检测器(5)附附属系系统它包括脱气气、梯度淋淋洗、恒温温、自动进进样、馏分分收集以及及数据处理理等装置。。其中梯度度淋洗装置置是高压液液相色谱仪仪中尤为重重要的附属属装置.20-3高高效液相色色谱的固定定相和流动动相（－）固定定相高效液相色色谱固定相相以承受高高压能力来来分类，可可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为为基质，可承受7.O×108～1.O××109Pa的高压压，可制成成直径、形形状、孔隙隙度不同的的颗粒。如如果在二氧氧化硅表面面键合各种种官能团，，就是键合合固定相，，可扩大应应用范围，，它是目前前最广泛使使用的一种种固定相。。硬胶主要用于离离子交换和和尺寸排阻阻色谱中，，它由聚苯乙烯与与二乙烯苯苯基交联而成。。可承受压压力上限为为3.5××108Pa。固定定相按孔隙隙深度分类类，可分为为表面多孔型型和全多孔孔型固定相相两类。1.表面多多孔型固定定相它的基体是是实心玻璃璃珠，在玻玻璃球外面面覆盖一层层多孔活性性材料，如如硅胶、氧氧化铝、离离子交换剂剂、分子筛筛、聚酸胺胺等。表面活性材材料为硅胶胶的固定相相如国外的的Zpax，CorasilI和II，Vydac，，Pellosil以及上海海试剂一厂厂的薄壳玻玻璃珠等；；表面活性性材料为氧氧化铝的固固定相，如如Pellumina；为聚聚酰胺的，，如Pellion。这类固定相相的多孔层层厚度小、、孔浅，相相对死体积积小，出峰峰迅速、柱柱效亦高；；颗粒较大大，渗透性性好，装柱柱容易，梯梯度淋洗时时能迅速达达平衡，较较适合做常常规分析。。由于多孔孔层厚度薄薄，最大允允许量受限限制。2．全多孔孔型固定相相它由直径为为10nm的硅胶微粒凝凝聚而成。如国外的的Porasil，，Zobbex、Lichrosorb系列，，上海试剂剂一厂的堆堆积硅珠，，青岛海洋洋化工厂的的YWG系系列，天津津试剂二厂厂的DG系系列等。也也可由氧化化铝微粒凝凝聚成全多多孔型固定定相，如国国外的LichrosorbALOXT。这类固定相相由于颗粒粒很细（5～10μμm），孔孔仍然较浅浅，传质速速率快，易易实现高效效、高速。。特别适合合复杂混合合物分离及及痕量分析析.（二）流动动相由于高效液液相色谱中中流动相是是液体，它它对组分有有亲和力，，并参与固固定相对组组分的竞争争。因此，，正确选择择流动相直直接影响组组分的分离离度。对流流动相溶剂剂的要求是是：（1）溶剂剂对于待测测样品，必须具有有合适的极极性和良好好的选择性性。（2））溶溶剂剂要要与与检检测测器器匹匹配配。对对于于紫紫外外吸吸收收检检测测器器，，应应注注意意选选用用检检测测器器波波长长比比溶溶剂剂的的紫紫外外截止止波波长长要长长。。所谓谓溶溶剂剂的的紫紫外外截截止止波波长长指指当当小小于于截截止止波波长长的的辐辐射射通通过过溶溶剂剂时时，，溶溶剂剂对对此此辐辐射射产产生生强强烈烈吸吸收收，此此时时溶溶剂剂被被看看作作是是光光学学不不透透明明的的，，它它严严重重干干扰扰组组分分的的吸吸收收测测量量。。表表20-2列列出出了了一一些些常常用用溶溶剂剂的的紫紫外外截截止止波波长长。。对于于折折光光率率检检测测器器，，要要求求选选择择与与组组分分折折光光率率有有较较大大差差别别的的溶溶剂剂作作流流动动相相，，以以达达最最高高灵灵敏敏度度。。（3））高高纯纯度度。由由于于高高效效液液相相灵灵敏敏度度高高，，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求求高高。。不不纯纯的的溶溶剂剂会会引引起起基基线线不不稳稳，，或或产产生生““伪伪峰峰””。。痕痕量量杂杂质质的的存存在在，，将将使使截截止止波波长长值值增增加加50～～IOOnm。。（4））化化学学稳稳定定性性好好。不不能能选选与与样样品品发发生生反反应应或或聚聚合合的的溶溶剂剂。。(5)低低粘粘度度。若若使使用用高高粘粘度度溶溶剂剂，，势势必必增增高高压压力力，，不不利利于于分分离离。。常常用用的的低低粘粘度度溶溶剂剂有有丙丙酮酮、、乙乙醇醇、、乙乙晴晴等等。。但但粘粘度度过过于于低低的的溶溶剂剂也也不不宜宜采采用用，，例例戊戊烷烷、、乙乙醚醚等等，，它它们们易易在在色色谱谱柱柱或或检检测测器器内内形形成成气气泡泡，，影影响响分分离离.20-4高高效效液液相相色色谱谱法法的的主主要要类类型型及及选选择择（－－））液液一一液液分分配配色色谱谱法法（（LLPC））在液液-液液色色谱谱中中,流流动动相相和和固固定定相相都都是是液液体体,它它能能适适用用于于各各种种样样品品类类型型的的分分离离和和分分析析，，无无论论是是极极性性的的和和非非极极性性的的，，水水溶溶性性和和油油溶溶性性的的，，离离子子型型的的和和非非离离子子型型的的化化合合物物。。1．．分分离离原原理理液液液分分配配色色谱谱的的分分离离原原理理基基本本与与液液液液萃萃取取相相同同，，都是是根根据据物物质质在在两两种种互互不不相相溶溶的的液液体体中中溶溶解解度度的的不不同同，，具具有有不不同同的的分分配配系系数数。。所不不同同的的是是液液液液色色谱谱的的分分配配是是在在柱柱中中进进行行的的，，使使这这种种分分配配平平衡衡可可反反复复多多次次进进行行，，造造成成各各组组分分的的差差速速迁迁移移，，提提高高了了分分离离效效率率，，从从而而能能分分离离各各种种复复杂杂组组分分。。2固固定定相相由于于液液液液色色谱谱中中流流动动相相参参与与选选择择竞竞争争，，因因此此，，对对固固定定相相选选择择较较简简单单。。只只需需使使用用几几种种极极性性不不同同的的固固定定液液即即可可解解决决分分离离问问题题。。例例如如，，最最常常用用的的强强极极性性固固定定液液β，，ββ′′一一氧氧二二丙丙睛睛，中中等等极极性性的的聚乙乙二二醇醇，非非极极性性的的角鲨鲨烷烷等。。为了了更更好好解解决决固固定定液液在在载载体体上上流流失失问问题题。。产产生生了了化学学键键合合固固定定相相。它它是是将将各各种种不不同同有有机机基基团团通通过过化化学学反反应应键键合合到到载载体体表表面面的的一一种种方方法法。。它它代代替替了了固固定定液液的的机机械械涂涂渍渍，，因因此此它它的的产产生生对对液液相相色色谱谱法法迅迅速速发发展展起起着着重重大大作作用用，，可以以认认为为它它的的出出现现是是液液相相色色谱谱法法的的一一个个重重大大突突破破。它它是是目目前前应应用用最最广广泛泛的的一一种种固固定定相相。。据据统统计计，，约约有有3/4以以上上的的分分离离问问题题是是在在化化学学键键合合固固定定相相上上进进行行的的。。详详细细介介绍绍见见后后。。3．．流流动动相相在液液液液色色谱谱中中为为了了避避免免固固定定液液的的流流失失。。对对流流动动相相的的一一个个基基本本要要求求是是流流动动相相尽尽可可能能不不与与固固定定相相互互溶溶，，而而且且流流动动相相与与固固定定相相的的极极性性差差别别越越显显著著越越好好。。根根据据所所使使用用的的流流动动相相和和固固定定相相的的极极性性程程度度，，将将其其分分为为正相相分分配配色色谱谱和反相相分分配配色色谱谱。如如果果采采用用流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正相相分分配配色色谱谱，它它适适用用于于极极性性化化合合物物的的分分离离。。其其流出出顺顺序序是是极极性性小小的的先先流流出出，，极极性性大大的的后后流流出出。如如果果采采用用流动动相相的的极极性性大大于于固固定定相相的的极极性性，称称为为反相相分分配配色色谱谱。它它适适用用于于非非极极性性化化合合物物的的分分离离，，其其流出出顺顺序序与与正正相相色色谱谱恰恰好好相相反反。。（二二））化化学学键键合合相相色色谱谱法法（（CBPC））采用用化学学键键合合相相的的液液相相色色谱谱称称为为化化学学键键合合相相色色谱谱法法，，简简称称键键合合相相色色谱谱。。由于于键键合合固固定定相相非非常常稳稳定定，，在在使使用用中中不不易易流流失失，，适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗，，特特别别适适用用于于分分离离容容量量因因子子k值值范范围围宽宽的的样样品品。。由由于于键键合合到到载载体体表表面面的的官官能能团团可可以以是是各各种种极极性性的的，，因因此此它它适适用用于于种种类类繁繁多多样样品品的的分分离离。。1．．键键合合固固定定相相类类型型用来来制制备备键键合合固固定定相相的的载载体体，，几几乎乎都都用用硅胶胶。利利用用硅硅胶胶表表面面的的硅硅醇醇基基(Si一一OH)与与有有机机分分可可成成键键,即即可可得得到到各各种种性性能能的的固固定定相相。。一一般般可可分分三三类类（1））疏水水基基团团如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（（C8和C18。））和和苯苯基基等等（2））极性性基基团团如氨氨丙丙基基，，氰氰乙乙基基、、醚醚和和醇醇等等。。（3））离子交换基团团如作为阴离子子交换基团的的胺基，季镀镀盐；作为阳离子交交换基团的的磺酸等.2．键合固定定相的制备（l）硅酸酯酯（≡Si一一OR）键合合固定相,它是最先用用于液相色谱谱的健合固定定相。用醇与与硅醇基发生生酯化反应：：≡Si－0H＋ROH→→≡Si－OR＋H20由于这类键合合固定相的有有机表面是一一些单体，具具有良好的传传质特性,但但这些酯化过过的硅胶填料料易水解且受受热不稳定，，因此仅适用于不含水水或醇的流动动相。（2）≡Si－C或Si一N共价键键合固定相制备反应如下下共价键健合固固定相不易水水解，并且热热稳定较硅酸酸酯好。缺点点是格氏反应应不方便；当当使用水溶液液时，必须限限制PH在4～8范围内内.（3）硅烷化化（≡Si——O－Si－－C）键合固固定相制备反应如下下：这类键会固定定相具有热稳稳定好，不易易吸水，耐有有机溶剂的优优点。能在70℃以下，，PH=2～～8范围内正正常工作，应应用较广泛.3．反相健合相相色谱法此法的固定相相是采用极性性较小的键合合固定相，如如硅胶一C18H37、硅胶一苯基基等；流动相相是采用极性性较强的溶剂剂，如甲醇十十、乙睛一水水、水和无机机盐的缓冲溶溶液等。它多多用于分离多多环芳烃等低低极性化合物物；若采用含含一定比例的的甲醇或乙睛睛的水溶液为为流动相，也也可用于分离离极性化合物物；若采用水水和无机盐的的缓冲液为流流动相，则可可分离一些易易离解的样品品，如有机酸酸、有机碱、、酚类等。反反相键合相色色谱法具有柱柱效高，能获获得无拖尾色色谱峰的优点点。关于反相键合合相色谱的分分离机理，可可用所谓疏溶溶剂作用理论论来解释。这这种理论把非非极性的烷基基键合相看作作一层键合在在硅胶表面上上的十八烷基基的“分子毛”，这种“分分子毛”有较较强的流水特特性。当用极极性溶剂为流流动相来分离离含有极性官官能团的有机机化合物时，，一方面，分分子中的非极极性部分与固固定相表面上上的疏水烷基基产生缔合作作用，使它保保留在固定相相中；而另一一方面，被分分离物的极性性部分受到极极性流动相的的作用，促使使它离开固定定相，并减小小其保留作用用（见图20-4）。显显然，两种作作用力之差，，决定了分子子在色谱中的的保留行为。。4.正相键合相色色谱法此法是以极性性的有机基团团，CN、NH2双羟基等键合合在硅胶表面面，作为固定定相；而以非非极性或极性性小的溶剂（（如烃类）中中加入适量的的极性溶剂（（如氯仿、醇醇、乙腊等））为流动相，，分离极性化化合物。此时时，组分的分配比比k值随其极极性的增加而而增大，但随流动相极极性的增加而而降低。这种色谱方法法主要用于分分离异构体、、极性不同的的化合物，特特别适用于分分离不同类型型的化合物。。5.离子性键合相相色谱法当以薄壳型或或全多孔微粒粒型硅胶为基基质，化学键键合各种离子子交换基团，，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等时，就形形成了离子性性键合相色谱谱的固定相；；流动相一般般采用缓冲溶溶液。其分离原理与离离子交换色谱谱类同。以上讨论了各各种类型化学学键合相色谱谱法，归纳键键合相色谱的的最大优点是是：通过改变变流动相的组组成和种类，，可有效地分分离各种类型型化合物（非非极性、极性性和离子型））。此外，由由于键合到载载体上的基团团不易流失，，特别适用于于梯度淋洗。。据统计，在在高效液相色色谱法中，约约有8O％的的分离问题是是用键合相色色谱法解决。。此法的最大缺缺点是不能用用于酸、碱度度过大或存在在氧化剂的缓缓冲溶液作流流动相的体系系。如何根据样样品极性种类类来选择化学学键合的固定定相，请参看看表20-3。（三）液一固固吸附色谱法法(LSAC)液一固吸附色色谱是以固体体吸附剂作为为固定相，吸吸附剂通常是是些多孔的固固体颗粒物质质，在它们的的表面存在吸吸附中心。液固色谱实质质是根据物质质在固定相上上的吸附作用用不同来进行行分离的。1．分离原理理当流动相通过过固定相（吸吸附剂）时，，吸附剂表面面的活性中心心就要吸附流流动相分子。。同时，当试试样分子（X）被流动相相带入柱内，，只要它们在在固定相有一一定程度的保保留就要取代代数目相当的的已被吸附的的流动相溶剂剂分用）于是是，在固定相相表面发生竞竞争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡衡时,有其中Kad为吸附附平衡衡常数数，值大大表示示组分分在吸吸附剂剂上保保留强强，难难于洗洗脱。。Kad值小,则保保留值值弱，，易于于洗脱脱。试试样中中各组组分据据此得得以分分离。。Kad值可通通过吸吸附等等温线线数据据求出出。2．固定定相吸附色色谱所所用固固定相相多是是一些些吸附附活性性强弱弱不等等的吸吸附剂剂，如如硅胶胶、氧氧化铝铝、聚聚酸胶胶等。。由于于硅胶胶的优优点较较多，，如线线性容容量较较高，，机械械性能能好，，不溶溶胀，，与大大多数数试样样不发发生化化学反反应等等，因因此，，以硅硅胶用用得最最多。。在高效效液相相色谱谱法中中，表表面多多孔型型和全全多孔孔型都都可作作吸附附色谱谱中的的固定定相，，它们们具有有填料料均匀匀、粒粒度小小。孔孔穴浅浅的优优点，，能极极大地地提高高柱效效。但但表面面多孔孔型由由于试试样容容量较较小，，目前前最广广泛使使用的的还是是全多孔孔型微微粒填填料。。3流动相相一般把把吸附附色谱谱中流动相相称作洗脱剂剂。在吸附附色谱谱中对对极性性大的的试样样往往往采用用极性性强的的洗脱脱剂；；对极极性弱弱的试试样宜宜用极极性弱弱的洗洗脱剂剂。洗洗脱剂剂的极极性强强弱可可用溶溶剂强强度参参数（（ε0）来衡衡量。。ε0越大，，表示示洗脱脱剂的的极性性越强强。表表20-4列出出一些些常用用溶剂剂在氧氧化铝铝吸附附剂中中的εε0值。在在硅胶胶吸附附剂中中ε0值的顺顺序相相同，，数值值可换换算（（ε0硅胶=0··77×εε0氧化铝铝）。。(四））离子子交换换色谱谱法（（IEC））此法是是利用用离子交交换原原理和和液相相色谱谱技术术的结结合来来测定定溶液液中阳阳离子子和阴阴离子子的一一种分分离分分析方方法。凡在在溶液液中能能够电电离的的物质质，通通常都都可用用离子子交换换色谱谱法进进行分分离。。它不不仅适适用无无机离离子混混合物物的分分离，，亦可可用于于有机机物的的分离离，例例如氨氨基酸酸、核核酸、、蛋白白质等等生物物大分分子。。因此此，应应用范范围较较广。。1．离离子交交换原原理离子交交换色色谱法法是利利用不不同待待测离离子对对固定定相亲亲和力力的差差别来来实现现分离离的。。其固定定相采采用离离子交交换树树脂，，树脂脂上分分布有有固定定的带带电荷荷基团团和可可游离离的平平衡离离子。。当待待分析析物质质电离离后产产生的的离子子可与与树脂脂上可可游离离的平平衡离离子进进行可可逆交交换，，其交交换反反应通通式如如下：：阳离子子交换换：阴离子子交换换：一般形形式：：R一一A＋＋B＝＝R－B＋A达平衡衡时，，以浓浓度表表示的的平衡衡常数数（离离子交交换反反应的的选择择系数数）：：式中[A]r，，[B]r分分别代代表树树脂相相中洗洗脱剂剂离子子（A）和和试样样离子子（B）的的浓度度，[A]、[B]则代代表它它们在在溶液液中的的浓度度。离离子交交换反反应的的选择择性系系数见见从表表示试试样离离子B对于于A型型树脂脂亲和和力的的大小小：KB/A越大，说明明B离子交交换能力越越大，越易易保留而难难于洗脱。。一般说来来，B离子电荷荷越大，水水合离子半半径越小，，KB/A值就越大。。对于典型的的磺酸型阳阳离子交换换树脂，一一价离子的的KB/A值按以下顺顺序：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的的顺序为：：Ba2+＞＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铝型型强碱阴离离子交换树树指，各阴阴离子的选选择性顺序序为：ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2．固定相作为固定相相的离子交交换剂，其其基质大致致有三大类类：合成树树脂（聚苯苯乙烯）、、纤维素和和硅胶。而而离子交换换剂又有阳阳离子和阴阴离子之分分。再根据据官能基的的离解度大大小还有强强弱之分（（见表20-5）常用的离子子交换剂固固定相大致致可分以下下几种：（l）多孔孔型离子交交换树脂它主要是聚聚苯乙烯和和二乙烯苯苯基的交联联聚合物，，直径约为为5～20μm，有有微孔型和和大孔型之之分[见图图20-6中（a））和（b））］。（2）薄膜型离离子交换树树脂它是在直径径约对30μm的固固体情性核核上，凝聚聚1～2μμm厚的树树脂层，如如图20-6中（c）。（3）表面面多孔型离离子交换树树脂它是在固体体情性核上上，覆盖一一层微球硅硅胶，再在在上面涂一一层很薄的的离子交换换树脂，如如图20-6中（d）所示。。（4）离子子交换键合合固定相它是用化学学反应将离离子交换基基团键合到到惰性载体体表面。它它也分为两两种类型。。一种是键键合薄壳型型，其载体体是薄壳玻玻珠。另一一种是键合合微粒载体体型，它的的载体是多多孔微粒硅硅胶。后者者是一种优优良的离子子交换固定定相，它的的优点是机机械性能稳稳定，可使使用小粒度度固定相和和高柱压来来实现快速速分离。3．流动相离子交换色色谱法所用用流动相大大都是一定pH和和盐浓度（或离子强强度）的缓缓冲溶液。。通过改变变流动相中中盐离子的的种类、浓浓度和pH值可控制制k值，改改变选择性性。如果增增加盐离子子的浓度，，则可降低低样品离子子的竞争吸吸附能力，，从而降低低其在固定定相上的保保留值。一般，对于于阴离子交交换树脂来来说，各种种阴离子的的滞留次序序为：柠檬酸离子子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬檬酸离子洗洗脱要比用用氟离子快快。阳离子子的滞留次次序大为：：Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差别不如如阴离子明明显。关于于pH值的的影响，要要视不同情情况而定。。例如，分分离有机酸酸和有机碱碱时，这些些酸碱的离离解程度可可通过改变变流动相的的pH值来来控制。增增大pH值值会使酸的的电离度增增加，使碱碱的电离度度减少；降降低PH值值，其结果果相反。但但无论属于于哪种情况况，只要电离度度增大，就就会使样品品的保留增增大。（五）离子子色谱法（（IC）离子色谱法法是由离子子交换色谱谱法派生出出来的一种种分离方法法。由于离子交交换色谱法法在无机离离子的分析析和应用受受到限制。。例如，对对于那些不不能采用紫紫外检测器器的被测离离子，如采采用电导检检测器，由由于被测离离子的电导导信号被强强电解质流流动相的高高背景电导导信号掩没没而无法检检测。为了了解决这一一问题，1975年年Small等人提提出一种能能同时测定定多种无机机和有机离离子的新技技术。他们们在离子交交换分离柱柱后加一根根抑制柱，，抑制柱中中装填与分分离柱电荷荷相反的离离子交换树树脂。通过分离柱柱后的样品品再经过抑抑制柱，使使具有高背背景电导的的流动相转转变成低背背景电导的的流动相，，从而用电电导检测器器可直接检检测各种离离子的含量量。这种色谱技技术称为离离子色谱。若样品为为阳离子，，用无机酸酸作流动相相，抑制柱柱为高容量量的强碱性性阴离子交交换剂。当当试样经阳阳离子交换换剂的分离离往后，随随流动相进进入抑制柱柱，在抑制制柱中发生生两个重要要反应：R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反应可见见：经抑制制柱后，一一方面将大大量酸转变变为电导很很小的水，，消除了流流动相本底底电导的影影响。同时时，又将样样品阳离子子M+转变变成相应的的碱，由于于OH-离子的淌度度为Cl-离子的2．．6倍，提提高了所测阳离子电电导的检测测灵敏度。对于阴离离子样品也也有相似的的作用机理理。在分离柱后后加一个抑抑制柱的离离子色谱亦亦称为抑制制型离子色色谱或称双双柱离子色色谱。由于于抑制柱要要定期再生生，而且谱谱带在通过过抑制柱后后会加宽，，降低了分分离度。后后来，Frits等等人提出采采用抑制柱柱的离子色色谱体系，，而采用了了电导率极极低的溶液液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或或邻苯二甲甲酸盐的稀稀溶液作流流动相，称称为非抑制制型离子色色谱或单柱柱离子色谱谱。（六）离子子对色谱法法（IPC）离子对色谱谱法是分离离分析强极极性有机酸酸和有机碱碱的极好方方法。它是是离子对革革取技术与与色谱法相相结合的产产物。在20世纪7O年代中中期，Schill等人首先先提出离子子对色谱法法，后来，，这种方法法得到十分分迅速的发发展。1．．离离子子对对色色谱谱法法原原理理离子子对对色色谱谱法法是是将将一一种种（（或或数数种种））与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（（称称对对离离子子或或反反离离子子））加加到到流流动动相相或或固固定定相相中中，，使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成离离子子对对，，从从而而控控制制溶溶质质离离子子保保留留行行为为的的一一种种色色谱谱法法。。关于于离离子子对对色色谱谱机理理，，至至今今仍仍不不十十分分明明确确，，已提提出出三三种种机机理理：：离离子子对对形形成成机机理理；；离离子子交交换换机机理理；；离离子子相相互互作作用用机机理理。。现现以以离离子子对对形形成成机机理理说说明明之之。。假假如如有有一一离离子子对对色色谱谱体体系系，，固固定定相相为为非非极极性性键键合合相相，，流流动动相相为为水水溶溶液液，，并并在在其其中中加加入入一一种种电电荷荷与与组组分分离离子子A-相反反的的离离子子B+，B+离子子由由于于静静电电引引力力与与带带负负电电的的人人组组分分离离子子生生成成离离子子对对化化合合物物A-B+。离离子子对对生生成成反反应应式式由于于离离子子对对化化合合物物A-B+具有有疏疏水水性性，，因因而而被被非非极极性性固固定定相相（（有有机机相相））提提取取。。组组分分离离子子的的性性质质不不同同，，它它与与反反离离子子形形成成离离子子对对的的能能力力大大小小不不同同以以及及形形成成的的离离子子对对流流水水性性质质不不同同，，导导致致各各组组分分离离子子在在固固定定相相中中滞滞留留时时间间不不同同，，因因而而出出峰峰先先后后不不同同。。这这就就是是离离子子对对色色谱谱法法分分离离的的基基本本原原理理。。2．．键键合合相相反反相相离离子子对对色色谱谱法法离子子对对色色谱谱法法类类型型很很多多，，根根据据流流动动相相和和固固定定相相的的极极性性可可分分为为反反相相离离子子对对和和正正相相离离于于对对色色谱谱法法。。其中中以以键键合合相相离离子子对对色色谱谱法法最最重重要要。。这种种色色谱谱法法的的固固定定相相采采用用非非极极性性的的疏疏水水键键合合相相［［如如十十八八烷烷基基键键合合相相（（ODS））等等］］，流流动动相相为为加加有有平平衡衡离离子子（（反反离离子子））的的极极性性溶溶液液（（如如甲甲醇醇一一水水或或乙乙睛睛一一水水））。。根据据离离子子对对生生成成反反应应式式，，平平衡衡常常数数KAB可表表示示为为根据据定定义义，，溶溶质质的的分分配配系系数数根据据上上两两式式，，有有式中中β为为相相比比率率。容容量量因因子子k随随KAB和[B+]水相相的增增大大而而增增大大。。键合合相相反反相相离离子子对对色色谱谱法法操操作作简简便便，，只只要要改改变变流流动动相相的的pH值值、、平平衡衡离离子子的的浓浓度度和和种种类类，，就就可可在在较较大大范范围围内内改改变变分分离离的的选选择择性性，，能能较较好好解解决决难难分分离离混混合合物物的的分分离离问问题题。。此此法法发发展展迅迅速速，，应应用用较较广广泛泛.（七七））尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱法法（（SEC））尺寸寸排排阻阻色色谱谱法法又又称称凝凝胶胶色色谱谱法法，，主要要用用于于较较大大分分子子的的分分离离。。与与其其他他液液相相色色谱谱方方法法原原理理不不同同，，它它不不具具有有吸吸附附、、分分配配和和离离子子交交换换作作用用机机理理，，而而是是基于于试试样样分分子子的的尺尺寸寸和和形形状状不不同同来来实实现现分分离离的的。。尺寸寸排排阻阻色色谱谱被被广广泛泛应应用用于于大大分分子子的的分1．分分离原原理尺寸排排阻色色谱是是按分分子大大小顺顺序进进行分分离的的一种种色谱谱方法法。其其固定定相为为化学学情性性多孔孔物质质———凝胶胶，它它类似似于分分子筛筛，但但孔径径比分分子筛筛大。。凝胶胶内具具有一一定大大小的的孔穴穴，体积大大的分分子不不能渗渗透到到孔穴穴中去去而被被排阻阻，较较早地地被淋淋洗出出来；；中等等体积积的分分子部部分渗渗透；；小分分子可可完全全渗透透入内内，最最后洗洗出色色谱柱柱。这样，，样品品分子子基本本上按按其分分子大大小，，排阻阻先后后由柱柱中流流出。。其渗渗透过过程模模型见见图20-7。。2．固固定相相排阻色色谱固固定相相种类类很多多，一一般可可分为为软性性、半半刚性性和刚刚性凝凝胶三三类。。表20-6列列出了了常用用的一一些固固定相相。所谓凝凝胶，，指含含有大大量液液体（（一般般是水水）的的柔软软而富富于弹弹性的的物质质，它它是一一种经经过交交联而而具有有立体体网状状结构构的多多聚体体。（1））软性性凝胶胶如葡聚聚糖凝凝胶、、琼脂脂糖凝凝胶都都具有有较小小的交交联结结构，，其微微孔能能吸入入大量量的溶溶剂，，并能能溶胀胀到它它们干干体的的许多多倍。。它们们适用用以水水溶性性溶剂剂作流流动相相，一一般用用于小小分子子质量量物质质的分分析，，不适适宜用用在高高效液液相色色谱中中。（2））半刚刚性凝凝胶如高交交联度度的聚聚苯乙乙烯（（Styragel）比比软性性凝胶胶稍耐耐压，，溶胀胀性不不如软软性凝凝胶。。常以以有机机溶剂剂作流流动相相。用用于高高效液液相色色谱时时，流流速不不宜大大。（3））刚性性凝胶胶如多孔孔硅胶胶、多多孔玻玻璃等等它们们既可可用水水溶性性溶剂剂，又又可用用有机机溶剂剂作流流动相相，可可在较较高压压强和和较高高流速速下操操作。。一般般控制制压强强小于于7MPa，流流速＜＜1cm3·s-1；否则则将影影响凝凝胶孔孔径，，造成成不良良分离离。3．流流动相相排排阻色色谱所所选用用的流流动相相必须须能溶溶解样样品，，并必必须与与凝胶胶本身身非常常相似似，这这样才才能润润湿凝凝胶。。当采采用软软性凝凝胶时时，溶溶剂也也必须须能溶胀胀凝胶胶。另外外，溶溶剂的的粘度度要小小，因因为高高粘度度溶剂剂往往往限制制分子子扩散散作用用而影影响分分离效效果。。这对对于具具有低低扩散散系数数的大大分子子物质质分离离，尤尤需注注意。。选择择溶剂剂还必必须与与检定定器相相匹配配。常常用的的流动动相有有四氢氢呋喃喃、甲甲苯、、氯仿仿、二二甲基基酸胺胺和水水等。。以以水水溶液液为流流动相相的凝凝胶色色谱适适用于于水溶溶性样样品，，以有有机溶溶剂为为流动动相的的凝胶胶色谱谱适用用于非非水溶溶性样样品。。(八)亲和和色谱谱法（（AC）简简介亲和色色谱是是利用用生物物大分分子和和固定定相表表面存存在某某种特特异性性亲和和力，，进行行选择择性分分离的的一种种方法法。它它通常常是在在载体体（无无机或或有机机填料料）表表面先先键合合一种种具有有一般般反应应性能能的所所谓间间隔臂臂（如如环氧氧、联联氨等等）；；随后后，再再连接接上配配基（（酶、、抗原原或激激素等等）。。这种种固载载化的的配基基将只只能和和具有有亲和和力特特性吸吸附的的生物物大分分子相相互作作用而而被保保留，，没有有这种种作用用的分分子不不被保保留。。图20-9为为亲和和色谱谱法示示意图图。（九））分离离类型型的选选择1．根根据相相对分分子质质量选选择相对分分子质质量十十分低低的样样品，，其挥挥发性性好，，适用用于气气相色色谱。。标准准液相相色谱谱类型型（液液一固固、液液一液液、及及离子子交换换色谱谱）最最适合合的相相对分分子质质量范范围是是20O～～2000。对对于相相对分分子质质量大大于2000的的样品品，则则用尺尺寸排排阻法法为最最佳。。2．根根据溶溶解度度选择择弄清样样品在在水、、异辛辛烷、、苯、、四氯氯化碳碳、异异丙醇醇中的的溶解解度是是很有有用的的。如如果样样品可可溶于于水井井属于于能离离解物物质，，以采采用离离子交交换色色谱为为佳；；如样样品可可溶于