分子生物学-原核表达调控

二、转录水平的调控1.转录调控的原理2.原核生物转录调控的操纵子学说乳糖操纵子与负控诱导系统色氨酸操纵子与负控阻遏系统其他操纵子转录水平上的其他调控方式

4.色氨酸操纵子(trpoperon)

trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程。操纵子中各基因功能：trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的α和β亚基。在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。分枝酸先在邻氨基苯甲酸合成酶作用下生成邻氨基苯甲酸，此后先与磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸，经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脱去3-磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚与一个丝氨酸缩合形成色氨酸。

E.Coli中Trp操纵子的结构

5个色氨酸合成代谢相关酶的基因构成一个操纵子。合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子P和操纵子O的调控。这些基因只有在缺乏Trp时，才被有效表达。

trp操纵子

基因产物是5个酶，分别是邻氨基苯甲酸合成酶(E)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(D)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶-吲哚甘油磷酸合成酶(C)、色氨酸合成酶β(B)和色氨酸合成酶α(A)。色氨酸操纵元的调控机制

trp操纵元——属阻遏型操纵元，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。

色氨酸操纵子通常处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。

4.1辅阻遏蛋白的负调控与lac操纵子的调控不同的是，控制Trp操纵子的阻遏蛋白的效应物（Trp）不是一个诱导物（inducer）,而是一个辅阻遏物（corepressor）。也就是说，Trp操纵子的调节基因的产物（阻遏物蛋白）无活性，不能与操纵基因结合；当Trp存在时，它与阻遏物蛋白结合，诱导该蛋白构象变化，能够结合在操纵基因上并阻止转录。调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成型方式低水平表达调控蛋白R’；R’并无活性。当提供足够的Trp时，Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R，R可与操纵基因O特异性结合，阻遏结构基因的转录，R的阻遏能力仅为lacI产物的1/1000。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。trpS(色氨酰tRNA合成酶)trpa当有足够的Trp时，操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。缺乏Trp时，Trp操纵子被打开，5个结构基因表达，产生3个酶催化分支酸合成为Trp。这是一种负性调控，操纵子通常是开放转录的。当有效应物(Trp)作用时，诱导使阻遏蛋白R’构象发生变化，能够结合于操纵基因，则阻遏转录。4.2色氨酸操纵子的衰减调控研究表明色氨酸操纵子存在两种机制的调控。如果trp操纵子只受trpR编码的阻遏物调控，那么在缺乏或存在色氨酸时，trpR突变使trp操纵子表达的酶量应该是相同的。可是，在trpR缺失突变体中，培养基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在时操纵子的表达水平更高，说明色氨酸操纵子除受阻遏物调控外，还受另一机制的调控。4.2.1弱化子与前导肽当阻遏物对trp操纵子的阻遏作用被解除，但细胞内仍有一定浓度的色氨酸时，第二种调控机制使trp操纵子的转录在抵达trpE之前被提前终止，这种现象称为弱化作用（attenuation），DNA中导致mRNA合成提前终止的一段序列称为弱化子（attenuator）。弱化作用产生的关键在于trpmRNA的前导区。在Trp操纵子Ptrp-O与trpE间有一段162bp的先导序列(leadingsequence,L)。在L内有一段123~150bp的序列，它在转录起始后可调控转录过程的进行。这段碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。

弱化子的共同特点是某些外部因素控制着弱化子的发夹形成。即形成终止子结构。弱化子为结构基因的转录设了一道关卡。前导肽分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。在前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。

先导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，它编码了一个14个AA的先导肽。编码先导肽的第10、11位是相邻的两个Trp密码子。先导序列含有3对反向重复序列(A=1+2；B=2+3；C=3+4)。如果B(2+3)形成发夹结构，A和C都不能再形成发夹结构。AC当A（1+2）形成发夹结构时，B就不能形成发夹结构，却有利于C（3+4）生成发夹结构。BC后是poly(U)，即C实际是一个终止子，如果转录mRNA时它形成发夹结构，就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来。mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。终止构型抗终止构型

无色氨酸时操纵子基因开始转录，此后转录速率受转录弱化机制(attenuation)调节。在结构基因与O

之间有一衰减子区域，该区域含有4段特殊的序列，高浓度色氨酸时能形成不依赖ρ因子的转录终止信号，RNA聚合酶脱落，转录终止。低浓度色氨酸时则不能形成转录终止信号，转录继续。4.2.2弱化子的负调控原核生物转录和翻译几乎同时进行，在Trp未达到能起阻遏作用的浓度时，从Ptrp起始转录，RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA，同时核糖体结合在mRNA上开始翻译。当Trp水平高时，已经起始了转录的RNA聚合酶在特定的位点暂停，接着在到达trpE之前终止。但当Trp缺乏时，聚合酶不终止，而是通读trp基因。Trp合成酶类的量与Trp浓度呈负相关，这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。

Trp浓度低时，生成Trp-tRNAtrp量少，使核糖体停止在mRNA上的Trp密码子UGG处；使A（1与2）不能形成发夹结构；而2+3形成发夹结构，阻止了3+4生成终止子；RNApol可沿DNA继续转录，trp操纵子就处于开放状态。Trp浓度高时，trp-tRNAtrp浓度随之升高，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2+3不能配对，而3+4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止，结构基因被关闭而不再合成色氨酸。Trp的存在对终止转录是有效的，弱化子仅允许约10%的RNA聚合酶通过。缺乏Trp时，弱化子允许所有的聚合酶通过。当所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于1+2和3+4发夹结构的形成，于是RNApol停止转录。色氨酸操纵子代表了一种衰减调控模式在trp操纵子上，弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度。a.高色氨酸条件下，序列3和4配对，形成转录终止发夹。b.低色氨酸条件下，核糖体停在色氨酸密码子附近，序列1被核糖体覆盖，序列2和3配对，因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c没有蛋白合成时，如果没有核糖体起始先导肽的翻译，序列1、2形成发夹，阻止了2、3发夹的形成，允许序列3、4形成转录终止发夹，酶不表达。

实验证据转录弱化理论得到了大量实验证据的支持：（1）影响区段3和区段4二级结构稳定性的突变以及改变区段4后面一串U的突变都会降低弱化子的终止作用，增加trp操纵子的表达，这与终止子的突变效应是一样的；（2）相反，影响影响区段2和3配对的突变，则增加弱化子的弱化作用；（3）如果前导肽的起始密码子发生错义突变，前导肽的翻译就不能起始，有利于前导RNA形成1－2、3－4二级结构，则转录必定在弱化子处终止。

有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做出关闭或启动trp操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量。阻遏与弱化作用的协调细菌中为什么需要弱化子系统呢？一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。或者，弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。

那么为什么还要有阻遏体系呢？没有阻遏体系，只有弱化，似乎也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济。事实上，自然界存在着不同类型的合成体系，例如组氨酸操纵子拥有在功能上与trp操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节。在trp操纵子中，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，通过前导肽的翻译来控制转录的进行。细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。

5.其他操纵子5.1半乳糖操纵子(galactoseoperon)Galactoseoperon包括3个结构基因（galE、galT、galk）表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactosetransferase)和半乳糖激酶(galactosekinase)参与Gal代谢，形成UDPGal，用于合成细胞壁。5.1.1半乳糖操纵子的结构及特点激酶KUDP转移酶T差向异构酶E半乳糖半乳糖+葡萄糖半乳糖-1-磷酸乳糖UDP-葡萄糖UDP-半乳糖葡萄糖UDP转移酶T细胞壁当细胞中缺乏葡萄糖时，这些酶可使Gal转变成G-1-P，供细菌生命活动需要。gal操纵子属于诱导型操纵子。调节基因galR距离结构基因galE、T、K及操纵区O等很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。Gal是gal操纵子的诱导物。Gal的跨膜运输需要galP基因产物的参与。gal操纵子的特点：

①它有两个启动子，相距仅5bp,每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；②有两个O区，一个在P区上游-67—53（OE），一个在结构基因galE内部（OI）。③cAMP-CAP位点在-24~-50之间。gal操纵子有两个相互重叠的启动子，可从两个不同的起始点（S1、S2）开始转录；gal操纵子有两个O区，一个在P区上游-67~53，另一个在结构基因galE内部。galP1的转录起始依赖于CRP，属于CRP激活型，因此只有培养基中无葡萄糖时才能进行转录，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖和CRP。高水平的CRP能抑制galP2的转录起始，属于CRP抑制型。因此它完全依赖于葡萄糖。即：当有CRP时，转录从S1开始，当无CRP时，转录从S2开始。葡萄糖存在时若无Gal，GalR可结合在galOE和OI上，并相互作用形成环，从S1、S2的转录都被阻遏。当gal存在时，GalR的阻遏解除，但由于葡萄糖的存在，P1不能启动而只有P2低水平启动转录。无葡萄糖存在；若存在gal，gal的阻遏解除，依赖于CRP的P1高水平表达产生利用Gal的酶类，以Gal为能源和碳源。cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1区复合物形成开链构象，从而起始基因转录。同时，由于S2在S1的上游且核苷酸部分重叠，S2与CAP位点靠近，在空间位置上这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制了S2起始的转录。双启动子的实验证据一类细菌突变株能在无葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达，由galP1起始转录）；另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的gal基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类（由galP2起始转录）。

gal操纵子双转录起点的作用半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的UDPGal是E.coli细胞壁合成的前体。在无外源Gal时，UDPGal是通过半乳糖差向异构酶（galE基因的产物）的作用由UDP-葡萄糖合成的。因此细胞必须一直能够合成差向异构酶才能正常生活。

现在设想只有galP1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是galP2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（galP2）进行本底水平的永久型合成，以及一个依赖于cAMP-CRP的启动子（galP1)对高水平合成进行调节。阿拉伯糖操纵子的结构及特点阿拉伯糖是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖。在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，分别编码3个酶：araB基因编码核酮糖激酶(ribulokinase)，araA编码L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase)，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。另外还有两个远离此基因簇的基因araE和araF，负责将阿拉伯糖运入细胞。5.2阿拉伯糖操纵子(arabinoseoperon)与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域、两个操纵区和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。

AraC蛋白的正、负调节作用araBADmRNA的合成需要一个有功能的AraC蛋白，这个蛋白与诱导物阿拉伯糖结合后才诱导araBAD基因表达。当AraC蛋白以正调控因子作用时，起始转录还需要cAMP-CRP的共同参与。AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。葡萄糖与阿拉伯糖对ara操纵子活性的影响培养基中含有葡萄糖，没有阿拉伯糖。因为培养基中含有葡萄糖，所以cAMP-CAP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与A位点结合，RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC