基因工程的基本条件全

生物工程专业核心课程基

因

工

程基因工程5

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基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程3基因工程的基本条件C用于基因转移的受体菌或细胞B用于基因克隆的载体A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶3基因工程的基本条件限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等产生生的平平头末末端5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G……3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C……5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性性核酸酸内切切酶II型限制制性核核酸内内切酶酶酶解解反应应的操操作大部分分II型核酸酸内切切酶需需要相相似的的反应应条件件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶酶100mM中盐酶酶150mM高盐酶酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸内内切酶酶的酶酶活性性：在在最佳佳反应应条件件下反反应1小小时时，完完全水解1mg标准DNA所需的的酶量量限制性性核酸酸内切切酶II型限制制性核核酸内内切酶酶酶解解反应应的操操作II型核酸酸内切切酶的的多酶酶联合合酶解解：对盐浓浓度要要求相相同的的酶，，原则则上可可以同同时酶酶切，，但应应注意意：5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘……GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘……CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性性核酸酸内切切酶II型限制制性核核酸内内切酶酶酶解解反应应的操操作II型核酸酸内切切酶的的多酶酶联合合酶解解：对盐浓浓度要要求不不同的的酶，，可采采取下下列方方法：：使用较较贵的的酶的的盐浓浓度，，加大大便宜宜酶的的用量量，同同时酶酶解低盐酶酶先切切，然然后补补加盐盐，高高盐酶酶再切切一种酶酶先切切，然然后更更换缓缓冲液液，另另一种种酶再再切0.1倍体积积的5MNaAcpH5.42.5倍体积积的冰冰冷乙乙醇冰浴5分分钟钟、高高速冷冷冻离离心10分分钟、、干燥燥限制性性核酸酸内切切酶影响限限制性性核酸酸内切切酶活活性的的因素素DNA样品的的纯度度：蛋白质质、苯苯酚、、氯仿仿、乙乙醇、、EDTA、、SDS、、NaCl等加大酶酶的用用量，，1mgDNA用10U酶加大反反应总总体积积延长反反应时时间限制性性核酸酸内切切酶影响限限制性性核酸酸内切切酶活活性的的因素素DNA样品的的甲基基化程程度：：大肠杆杆菌中中的dam甲基化化酶在在5‘GATC3’序列中中的腺腺嘌呤N6位引入甲甲基，，受其其影响响的酶酶有BclI、MboI等，但但BamHI、、BglII、、Sau3AI不受影影响大肠杆杆菌中中的dcm甲基化化酶在在5‘CCAGG3’’或5‘CCTGG3’’序列中的胞嘧啶啶C5位上引入入甲基基，受其影影响的的酶有有EcoRII等哺乳动动物中中的甲甲基化化酶在在5‘CG3’序列中中的C5位上引入入甲基基限制性性核酸酸内切切酶影响限限制性性核酸酸内切切酶活活性的的因素素核酸内内切酶酶的缓缓冲液液性质质：高浓度度的酶酶、高高浓度度的甘甘油、、低离离子强强度、、极端端pH值等，会使一一些核核酸内内切酶酶的识识别和和切割割序列列发生生低特特异性性，即即所谓的的Staractivity现象EcoRI在正常常条件件下识识别并并切割割5‘‘GAATTC3’序列，，但在在甘油浓度度超过过5%（v/v）时，也也可切切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’DNA连接酶DNA连接酶的的基本性性质修复双链链DNA上缺口处处的磷酸酸二酯键键DNA连接酶5‘……G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘……C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘……G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA连接酶DNA连接酶的的基本性性质修复与RNA链结合的的DNA链上缺口口处的磷磷酸二酯酯键T4-DNA连接酶5‘……G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A3‘……C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘……G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’’3‘……C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA连接酶DNA连接酶的的基本性性质连接多个个平头双双链DNA分子：5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

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…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶的的反应条条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的的酶活性性：在最最佳反应应条件下下15℃反应1小时时，完全连接接1mgl-DNA（HindIII片段）所所需的酶酶量DNA连接酶平头双链链DNA片段的连连接操作作从分子动动力学的的角度讲讲，由限限制性核核酸内切切酶创造造的粘性性末端的的连接属属于分子子内部的的连接，，而平头头末端的的连接则则属于分分子间的的连接，，因此后后者反应应速度要要慢得多多提高平头头末端连连接效率率的方法法包括：：加大连接接酶用量量（10倍大于粘粘性末端端的连接接）加大平头头末端底底物的浓浓度，增增加分子子间碰撞撞机会加入10%PEG8000，促进大分分子之间间的有效效作用加入单价价阳离子子（NaCl），最终浓度度150-200mMDNA聚合酶大肠杆菌菌DNA聚合酶I（DNApolI））5‘→3‘的DNA聚合酶活活性5‘→3‘的核酸外外切酶活活性3‘→5‘的核酸外外切酶活活性大肠杆菌菌DNA聚合酶I的基本性性质：3‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘……C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大肠杆菌菌DNA聚合酶I（DNApolI））缺口前移移标记法法大肠杆菌菌DNA聚合酶I的基本用用途：5‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP））5‘……G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A……5‘‘5‘‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T……3’’3‘‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A……5‘‘Nicktranslation制备备32P标记记的的探探针针DNaseIDNApolIDNA聚合合酶酶大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本性性质质：：大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶I经枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶处处理理，，获获得得N端三分分之之二二的的大大肽肽段段，，即即为为Klenow酶Klenow酶仍仍拥拥有有5‘‘→→3‘‘的DNA聚合合酶酶活活性性和3‘‘→→5‘‘的核核核酸酸外外切切酶酶活活性性，但但失失去去了了5‘‘→→3‘‘的核核酸酸外外切切酶酶活活性性DNA聚合合酶酶大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：补平平由由核核酸酸内内切切酶酶产产生生的的5‘‘粘粘性性末末端端DNA片段段的的同同位位素素末末端端标标记记cDNA第二二链链的的合合成成双脱脱氧氧末末端端终终止止法法测测定定DNA序列列DNA聚合合酶酶大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：补平平由由核核酸酸内内切切酶酶产产生生的的5‘‘粘粘性性末末端端5‘‘……G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C……5’’KlenowdATPdTTP5‘‘……G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C……5’’DNA聚合合酶酶大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶I大片片段段（（Klenow））Klenow酶的的基基本本用用途途：：DNA片段段的的同同位位素素末末端端标标记记5‘‘……G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C……5’’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘‘……G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C……5’’DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA酶的的基基本本特特性性：：在无无dNTP时，，可可以以从从任任何何3‘‘-OH端外外切切在只只有有一一种种dNTP时，，外外切切至至互互补补核核苷苷酸酸暴暴露露时时停停止止在四四种种dNTP均存存在在时时，，聚聚合合活活性性占占主主导导地地位位5‘‘→→3‘‘的DNA聚合合酶酶活活性性和和3‘‘→→5‘‘的核核酸酸外外切切酶酶活活性性DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶的的基基本本用用途途：：切平平由由核核酸酸内内切切酶酶产产生生的的3’粘性性末末端端5‘‘……G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C……5’’T4-DNA聚合合酶酶5‘‘……G-C-T-C-OHP-G-G-A-G……3’’3‘‘……C-G-A-G-PHO-C-C-T-C……5’’注意意：：该该酶酶也也能能降降解解双双链链DNA，只是是其其活活性性比比单单链链降降解解活活性性低低很很多多DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶T4-DNA聚合合酶酶的的基基本本用用途途：：DNA片段段的的同同位位素素末末端端标标记记5‘‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’’3‘‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘Mg2+5‘‘pppdN5‘‘pppdA（（a-32P-dATP））5‘‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘T4-DNApolT4-DNApol5‘‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’’3‘‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘‘DNA聚合合酶酶依赖赖于于RNA的DNA聚合合酶酶（（反反转转录录酶酶））反转转录录酶酶的的基基本本特特性性：：以RNA为模模板板聚聚合合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’’mRNA反转转录录酶酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’’cDNADNA聚合合酶酶依赖赖于于RNA的DNA聚合合酶酶（反转转录录酶酶的的基基本本特特性性：：双向向外外切切DNA-RNA杂合合链链中中的的RNA链反转转录录酶酶3’’RNA5’’DNA3’’5’’3’’RNA5’’DNA3’’5’’反转录酶5’DNA3’核酸酶单链核酸外切切酶：核酸外外切酶VII（ExoVII））大肠杆菌的核核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶双链核酸外切切酶：核酸外外切酶III（ExoIII））ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核核酸外切酶III特异性地从3‘端外切切核酸酶双链核酸外切切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特特异性地从5‘端外切切3’5’3’5’核酸酶单链核酸内切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本特性：来自自稻谷曲霉菌菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解解双链DNA快75000倍降解单链DNA的速度比降解解单链RNA快7倍核酸酶单链核酸内切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本反应：内切单链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶单链核酸内切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本本反应：内切带缺口或或切口的双链链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶单链核酸内切切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA杂交S1EcoRI核酸酶单链内切双链链外切的核酸酸酶：Bal31核酸酶S1核酸酶的基本本特性：来自自艾氏交替单单胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶单链内切双链链外切的核酸酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本本用途：诱发发DNA突变EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化AC核酸修饰酶末端脱氧核苷苷酰转移酶（（TdT）TdT的基本特性：：来自小牛胸胸腺不需要模板的的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘TdT的基本特性：：5‘p3‘HOOH3‘‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘‘p5‘AAAAAAAAAAA核酸修饰酶碱性磷酸单酯酯酶来自小牛胸腺腺的碱性磷酸酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌菌的碱性磷酸酸单酯酶（BAP）5‘pOH3‘DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修饰酶T4-多核苷酸磷酸酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+pppATP（（g-32P-ATP））5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探针的末末端同位素标标记：B用于基因克隆隆的载体3基因工程的基基本条件质粒（plasmid）噬菌体或病毒毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载载体载体的功能及及特征载体的功能及及特征载体的功能运送外源基因因高效转入受受体细胞为外源基因提提供复制能力力或整合能力力为外源基因的的扩增或表达达提供必要的的条件载体的功能及及特征载体应具备的的条件具有针对受体体细胞的亲缘缘性或亲和性性（可转移性性）具有合合适的的筛选选标记记具有较较高的外外源DNA的载装装能力力具有多多种单单一的的核酸酸内切切酶识识别切切割位位点具有与与特定定受体体细胞胞相适适应的的复制制位点点或整整合位位点质粒质粒的的基本本特征征质粒是是生物物细胞胞内固固有的的、能能独立立于寄寄主染染色体体而自自主复复制、、并被稳定定遗传传的一一类核核酸分分子质粒常常见于于原核核细菌菌和真真菌中中绝大多多数的的质粒粒是DNA型的绝大多多数的的天然然DNA质粒具具有共共价、、封闭闭、环环状的的分子子结构构，即cccDNA质粒DNA的分子子量范范围：：1-300kb质粒质粒的的基本本特征征质粒的的自主主复制制性质粒能能利用用寄主主细胞胞的DNA复制系系统进进行自自主复复制质粒DNA上的复复制子子结构构决定定了质质粒与与寄主主的对对应关关系根据在在每个个细胞胞中的的分子子数（（拷贝贝数））多寡寡，质质粒可可分为为两大复复制类类型：：严紧型型复制制控制制的质质粒1-3拷拷贝stringentplasmid松弛型型复制制控制制的质质粒10-60拷拷贝stringentplasmid质粒质粒的的基本本特征征质粒的的自主主复制制性：：拷贝数数的控控制机机制––质质粒粒DNA复制启启动控控制控制复复制引引物与与模板板的结结合oriE.coliColE1plasmid复制方方向rop（+））RopRNAIIRNAI3’5’5’3’质粒质粒的的基本本特征征质粒的的自主主复制制性：：拷贝数数的控控制机机制––质质粒粒DNA复制启启动控控制控制复复制起起始因因子与与复制制起始始位点点（ori）的结合合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒质粒的的基本本特征征质粒的的不相相容性性任何两两种含含有相相似复复制子子结构构的不不同质质粒，，不能能同时时存在在于一个细细胞中中，这这种现现象称称为质粒的的不相相容性性，不相相容性性的质质以大肠肠杆菌菌的质质粒为为例：：ColE1、pMB1拥有相相似的的复制制子结结构，，彼此此不相相容pSC101、、F、、RP4拥有相相似的的复制制子结结构，，彼此此不相相容p15A及其衍衍生质质粒拥拥有相相似的的复制制子结结构，，彼此此不相相容粒组成成不相容容性群群质粒质粒的的基本本特征征质粒的的不相相容性性：分子机机制两种含含有相相似复复制子子结构构的不不同质质粒，，在复复制时时受到到同一一种拷贝数数控制制系统统的干干扰，，致使使两种种质粒粒的最最终拷拷贝数数不同同，两种含含有不不同复复制子子结构构的不不同质质粒，，在复复制时时各受受自己己的拷贝数数控制制系统统的调调节，，致使使两种种质粒粒的最最终拷拷贝数数恒定定，因此在在经过过若干干复制制周期期和细细胞分分裂周周期后后仍能能共处处于同同一细胞内内其中拷拷贝数数多的的质粒粒在以以后的的细胞胞分裂裂周期期中更更具优优势质粒质粒的的基本本特征征质粒的的可转转移性性革兰氏氏阴性性菌的的质粒粒可分分成两两大类类：接合型型质粒粒能在天天然条条件下下自发发地从从一个个细胞胞转移移到另一个个细胞胞（接接合作作用）），如如F、Col、R质粒等等如Col、R的其它它成员员非接合合型质质粒不能在在天然然条件件下独独立地地发生生接合合作用用值得注注意的的是，，某些些非接接合型型质粒粒（ColE1）在接合合型质质粒的存在在和协协助下下，也也能发发生DNA转移，，这个个过程程由bom和mob基因决决定质粒质粒的的基本本特征征携带特特殊的的遗传传标记记野生型型的质质粒DNA上往往往携带带一个个或多多个遗遗传标标记基基因，，这使得寄寄主生生物产产生正正常生生长非非必需需的附附加性性状，，包括括：物质抗抗性抗生素素、重重金属属离子子、毒毒性阴阴离子子、有有机物物物质合合成抗生素素、细细菌毒毒素、、有机机碱这些标标记基基因对对DNA重组分分子的的筛选选具有有重要要意义义质粒质粒的的构建建天然存存在的的野生生型质质粒由由于分分子量量大、、拷贝贝数低低、单单一酶酶切位位点少少、遗遗传标标记不不理想想等缺缺陷，，不能能满足足克隆隆载体体的要要求，，因此此往往往需要要以多多种野野生型型质粒粒为基基础进进行人人工构构建。。目前实实验室室使用用的大大肠杆杆菌质质粒大大多是是由少少数几几个野野生型型质粒粒构建建的：：pSC1018.8kb拷贝数数5四四环环素抗抗性标标记基基因TcrColE16.5kb拷贝数数20-30大大肠肠杆菌菌内毒毒素标标记基基因E1RSF2124ColE1衍生质质粒氨氨苄青青霉素素抗性性标记记基因因Apr质粒质粒的的分类类人工构构建的的质粒粒根据据其功功能和和用途途可分分成如如下几几类：：高拷贝贝质粒粒突变拷拷贝数数控制制基因因拷拷贝贝数1000-3000扩扩增增基因因低拷贝贝质粒粒来自pSC101拷贝数数小于于10表达某某些毒毒性基基因温敏质质粒在不同同温度度下表表现出出拷贝贝数、、整合合等不不同性性质测序质质粒含有测测序通通用引引物互互补序序列和和多酶酶接头头polylinker整合质质粒装有整整合促促进基基因及及位点点便便于于外源源基因因的整整合穿梭质质粒装有针针对两两种不不同受受体的的复制制子便便于基基因克克隆表达质质粒装有强强化外外源基基因表表达的的转录录、翻翻译、、纯化化的元元件探针质质粒装有报报告基基因便便于启启动子子等元元件的的克隆隆筛选选质粒重要的的大肠肠杆菌菌质粒粒载体体松弛型型复制制pBR322：：氯霉素素可扩扩增拷贝数数50-100/cell用于基基因克克隆质粒重要的的大肠肠杆菌菌质粒粒载体体pUC18/19：：拷贝数数2000-3000/cell用于基基因克克隆和和测序序装有多多克隆隆位点点（MCS）正选择择颜色色标记记lacZ’’质粒重要的的大肠肠杆菌菌质粒粒载体体pUC18/19：：正选择择标记记lacZ’’的显色色原理理pUC18/19PlaclacZ’’MCSb-半乳糖糖苷酶酶的a-肽段ab5-溴-4-氯氯-3-吲吲哚基基-b-D-半乳糖糖苷X-gal质粒重要的的大肠肠杆菌菌质粒粒载体体pGEM-3Z：多拷贝贝装有两两个噬噬菌体体的强强启动动子装有多多克隆隆位点点（MCS）正选择择颜色色标记记lacZ’’用于外外源基基因的的高效效表达达注意：：T7和SP6启动子子特异异性地地由噬噬菌体体DNA编码的的RNA聚合2743bpMCSlacZ’’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识识别，，因此此相应应的受受体菌菌必须须表达达噬菌菌体RNA聚合酶酶，如如：E.coliBL21（（DE3））等质粒质粒DNA的分离离纯化化实验室室一般般使用用下列列三种种方法法制备备质粒粒DNA：氯化铯铯密度度梯度度离心心法质粒DNA纯度高高、周周期长长、设设备要要求高高、溴溴乙锭锭污染染碱溶法法质粒DNA纯度底底、快快速、、操作作简便便沸水浴浴法质粒DNA纯度、、操作作周期期介于于氯化化铯法法和碱碱溶法法之间间质粒质粒DNA的分离离纯化化氯化铯铯密度度梯度度离心心法：：用含有有EDTA的缓冲冲液悬悬浮菌菌体加溶菌菌酶裂裂解细细菌细细胞壁壁加CsCl和溴乙乙锭超速离离心过过夜在紫外外灯下下吸取取cccDNA稀释沉沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒质粒DNA的分离离纯化化碱溶法法：用含有有EDTA的缓冲冲液悬悬浮菌菌体加溶菌菌酶裂裂解细细菌细细胞壁壁加NaOH和SDS的混合合溶液液，去去膜释释放内内含物物加高浓浓度的的醋酸酸钾溶溶液，，沉淀淀染色色体，，去除除染色体DNA及大部部分蛋蛋白质质离心取取上清清液，，用苯苯酚-氯仿仿萃取取，去去除痕痕量的的蛋白白质乙醇或或异丙丙醇沉沉淀水水相质质粒DNA用无DNase的RNase去除残残余的的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA质粒质粒DNA的分离纯纯化沸水浴法法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液液悬浮菌菌体加溶菌酶酶裂解细细菌细胞胞壁沸水浴40秒钟钟离心，用用无菌牙牙签挑去去沉淀物物乙醇或异异丙醇沉沉淀质粒粒DNA噬菌体或或病毒DNA噬菌体或或病毒是是一类非非细胞微微生物，，能高效效率高特特异性地地侵染宿主细胞胞，然后后或自主主复制繁繁殖，或或整合入入宿主基基因组中中潜伏起来，而而且在一一定的条条件下上上述两种种状态还还会相互互转化。。噬菌体或或病毒的的上述特特性使得得它们的的DNA能被开发发成为基基因工程的有用用载体，，因为：：高效率的的感染性性能使外外源基因因高效导导入受体体细胞自主复制制繁殖性性能使外外源基因因在受体体细胞中中高效扩扩增噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl噬菌体的的生物学学特性：：生物结构构l噬菌体是是大肠杆菌菌的温和和型噬菌菌体l噬菌体由外壳包包装蛋白白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸酸l-DNA上至少有61个基基因l噬菌体生生物学特特性：生物结构构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成成基因尾部合成成基因溶菌控制制基因晚期控制制基因DNA合成控制制基因阻遏基因因早期控制制基因阻遏基因因重组基因因删除与整整合基因因l-DNA噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl噬菌体生生物学特特性：感染周期期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl噬菌体生生物学特特性：感染周期期体内包装装100个个左右的的拷贝包装范围围为原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl噬菌体生生物学特特性：溶原状态态l噬菌体感感染大肠肠杆菌后后，除能能裂解细细胞外，，也可能能将其DNA直接整合合到宿主主细胞的的染色体体DNA上，并不不产生子子代噬菌菌体颗粒粒，这种种情况为为溶原状态态。整合主主要由l-DNA上的cI和int两基因的的产物所所激活，，而这两两个基因因的开放放与关闭闭又取决决于宿主主细胞本本身的性性质。人人们可以以根据需需要改变变l-DNA或宿主细细胞的性性质，使使噬菌体体或处于于溶菌状态态，或处于于溶菌状状态DNA重组技术术一般需需要l噬菌体进进入溶菌菌状态噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：缩短长度度野生型l-DNA包装的上上限为51kb，本身长度度为48.5kb，只有当插插入的外外源DNA片段不大大于2.5kb时，才能被被包装成成有感染染力的噬噬菌体颗颗粒。因因此缩短短野生型型l-DNA的长度，，可以提提高装载载量。其其实野生生型l-DNA上约有40-50%的片段是是复制和和裂解所所非必需需的。根根据切除除的多少少，可将将l-DNA分成两大大类载体体：插入型载载体取代型载载体噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：缩短长度度插入型载载体体外包装装插入位点点体外包装装插入片段段载体长度度37kb插入片段段大小：：0-14kb（51––37）噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：缩短长度度取代型载载体体外包装装体外包装装插入片段段最小装载载长度10kb（51––26）载体长度度26kb插入片段段最大装载载长度25kb（36––26）噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：删除重复复的酶切切位点野生型的的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不不利于重组组操作，，必须删删除至1-2个同时，为为了便于于各种来来源的DNA片段的克克隆，还还需要增增加一些单一的的酶切位位点除了简单单的切割割外，还还需要采采用定点点突变技技术去除除或增添添酶位点噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：加装选择择标记与质粒不不同，野野生型l-DNA上缺少合合适的选选择标记记，因此此加装选择标记记是l-DNA克隆载体体构建的的重要内内容l-DNA克隆载体体上的选选择标记记主要有有下列两两类：免疫功能能类标记记颜色反应应类标记记噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：加装选择择标记imm434imm434基因编码码一种阻阻止l-噬菌体进入溶菌菌循环的的阻遏物物。含有有完整标标记基因的l-载体进入入受体细细胞后，，建立溶溶原状态，，细菌生生长缓慢慢，形成成浑浊斑斑；当外源DNA插入到标标记基因因中，基基因灭活，l-重组分子子便进入入溶菌循循环，形形成透明斑噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：加装选择择标记lacZlacZ基因编码码b-半乳糖苷苷酶，能能催化无色的X-gal生成蓝色色化合物物。当外外源基因插入到到lacZ基因中，，基因灭灭活，不不能合成蓝色色化合物物；而空空载体l-DNA则产生蓝色透透明斑噬菌体或或病毒DNA大肠杆菌菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构构建：构建琥珀珀密码子子的突变变体琥珀型突突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。。大肠杆杆菌的某某些菌株株含有特特异性的的校正基基因，其其编码产产物校正正tRNA能专一性性地纠正正这一突突变。将野野生生型型l-DNA上D和E两个个头头部部包包装装蛋蛋白白的的基基因因中中的的CAG密码码子子突突变变成成UAG。当这这种种l-DNA进入入一一般般的的大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株后后，，不不能能合合成成有有活活性性的的头头部部蛋蛋白白，，也也就就不不能能被被包包装装和和裂裂解解细细菌菌，，这这样样就就可可以以阻阻止止有有害害重重组组体体的的生生物物污污染染及及扩扩散散，，而而基基因因工工程程实实验验中中使使用用的的受受体体则则是是具具有有琥琥珀珀型型突突变变体体校校正正功功能能的的菌菌株株噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的l噬菌菌体体DNAl-DNA载体体的的主主要要类类型型：：插入入灭灭活活型型载载体体Charon2、、Charon6、、lgt11取代代型型载载体体lEMBL4、、lgtlc、、lNM762、、Charon40正选选择择型型载载体体lEMBL1、、lL47、、l1059野生生型型的的l噬菌菌体体不不能能在在P2噬菌菌体体溶溶源源性性的细细菌菌中中繁繁殖殖（（Spi+），，这种种生生长长抑抑制制表表型型受受l-DNA上的的red和gam两个个基基因因控控制制。。若若将将外外源DNA取代代red和gam，重组组噬菌菌体体便便拥拥有有Spi-表型型，，能能在在P2噬菌菌体溶源源性性的大大肠肠杆杆菌菌受受体体菌菌中中繁繁殖殖，，并并形形成成透透明明斑斑噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的l噬菌菌体体DNAl-DNA重组组分分子子的的体体外外包包装装：：l-DNA重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组组颗颗粒粒，，方方可可高高效效导导入入受受体体细细胞胞用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取，，现现已已商商品品化化。。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分为为相相互互互互补补的的两两部部分分：：一一部部分分缺缺少少E组份份，，另另一一部部分分则则缺缺少少D组份份。。包包装装时时，，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组l-DNA分子子混混合合后后，，包包装装才才能能有有效效进进行行，，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组l-DNA污染染后后，，均均不不能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒，，这这也也是是基基于于安安全全而而设设计计的的噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的l噬菌菌体体DNAl-DNA及其其重重组组分分子子的的分分离离纯纯化化：：将大大肠肠杆杆菌菌在在含含有有麦麦芽芽糖糖的的培培养养基基中中培培养养至至对对数数生生长长期期加入入l噬菌菌体体或或重重组组l噬菌菌体体的的悬悬浮浮液液，，37℃培培养养1小时时用新新鲜鲜培培养养基基稀稀释释，，继继续续培培养养4-12小时时。。这这时时噬噬菌菌体体颗颗粒粒密度度已已达达1013-1014/L，大肠肠杆杆菌菌细细胞胞已已完完全全裂裂解解超速速离离心心，，沉沉淀淀噬噬菌菌体体苯酚酚抽抽提提，，释释放放l-DNA乙醇醇或或异异丙丙醇醇沉沉淀淀l-DNA噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的l噬菌菌体体DNAl-DNA作为为载载体体的的优优点点：：l-DNA可在在体体外外包包装装成成噬噬菌菌体体颗颗粒粒，，能能高高效效转转染染大大肠肠杆杆菌菌l-DNA载体体的的装装载载能能力力为为25kb，远远远大大于于质质粒粒的的装装载载量量重组组l-DNA分子子的筛筛选选较较为为方方便便重组组l-DNA分子子的的提提取取较较为为简简便便l-DNA载体体适适合合克克隆隆和和扩扩增增外外源源DNA片段段，，但但不不适适合合表表达达外源源基基因因噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的M13单链链噬噬菌菌体体DNAM13噬菌菌体体的的生生物物学学特特性性：：生物物结结构构M13噬菌菌体体的的外外型型呈呈丝丝状状M13噬菌菌体体由外外壳壳包包装装蛋蛋白白和和正链DNA组成成M13DNA全长长6407个核核苷苷酸酸M13DNA上至少少有有10个个基基因因2700个个外外壳壳蛋蛋白白分分子子M13噬菌菌体体不裂裂解解宿宿主主细细胞胞，，但但抑抑制制其其生生长长噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的M13单链链噬噬菌菌体体DNAM13噬菌菌体体的的生生物物学学特特性性：：感染染周周期期+DNA（+））DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的M13单链链噬噬菌菌体体DNAM13DNA载体体的的构构建建：：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生生型型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列列载载体体lacZ‘‘polylinker噬菌菌体体或或病病毒毒DNA大肠肠杆杆菌菌的的M13单链链噬噬菌菌体体DNAM13DNA载体体的的特特点点：：使克克隆隆的的DNA片段段以以特特定定单单链链的的形形式式输输出出受受体体细细胞胞外外这在在DNA定向向突突变变中中非非常常有有用用M13重组组分分子子筛筛选选简简便便被M13噬菌菌体体感感染染的的受受体体细细胞胞生生长长缓缓慢慢，，形形成成混混浊斑斑，，易易于于辨辨认认挑挑选选。。而而且且重重组组分分子子越越大大，，混混浊浊斑的的混混浊浊度度亦亦越越大大但M13-DNA载体体的的最最大大缺缺陷陷是是装装载载量量小小，，只只有有1.5kb噬菌菌体体或或病病毒毒DNA与动动植植物物受受体体细细胞胞相相适适应应的的载载体体一一般般选选择择相相应应动动植植物物的的病病毒基基因因组组DNA。动植植物物病病毒毒种种类类繁繁多多，，每每一一种种动动植植物物都都有有多多种种特特异异性性的的病病毒。按照照基因组组的结构构，可将将动植物物病毒分分成四大大类：单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒RNA病毒在自自我复制制时大多多存在相相应的DNA中间反应应物，这些中间间体可作作为载体体进行常常规的DNA重组。考斯质粒粒与噬菌菌粒l-DNA载体和M13-DNA载体的装装载量最最大分别别为25kb和1.5kb，但在很多多情况下下，往往往需要克隆更大大的外源源DNA片段，考斯质粒粒和噬菌菌粒载体体的构建建就是为为了进一一步提高高噬菌体体DNA的装载量量。在包装上上限固定定的条件件下，大大幅度缩缩短噬菌菌体DNA的长度，，就能同步步增加载载体的装装载能力力。将噬噬菌体DNA与包装有有关的序序列与质粒粒组装在在一起，，既能最最大限度度地缩短短载体的的长度，，同时又能保证证重组DNA分子在体体外仍被被包装成成有感染染力的颗颗粒，这这便是构建建考斯质质粒和噬噬菌粒载载体的思思路。当当然，由由于考斯斯质粒和噬菌粒粒不再携携带包装装蛋白基基因，因因此重组组DNA分子在细细胞内不能形成成噬菌体体颗粒。。考斯质粒粒与噬菌菌粒考斯质粒粒（cosmid））考斯质粒粒载体的的构建：：考斯质粒粒是一类类人工构构建的含含有1978年Collins和Hohn发明构建建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和质粒复制制子的特殊类型型的载体体cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围围为31-45kb考斯质粒粒与噬菌菌粒考斯质粒粒（cosmid））考斯质粒粒载体的的特点：：能像l-DNA那样进行行体外包包装，并并高效转转染受体体细胞装载量大大（45kb）且克隆片片段具有有一定的的大小范范围能像质粒粒那样在在受体细细胞中自主复复制重组操作作简便，，筛选容容易不能体内内包装，，不裂解解受体细胞胞考斯质粒粒与噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）噬菌粒载载体的特特点：噬菌粒是是一类人人工构建建的含有有单链噬噬菌体包装序列列、复制制子以及质粒复制制子、克克隆位点点、标记记基因的的特殊类类型的载载体能像M13-DNA那样体外外包装，，并高效效转染受受体细胞胞装载量比比常规的的M13mp系列要大大很多（（10kb）能像质粒粒那样在在受体细细胞中自主复复制重组操作作简便，，筛选容容易通过克隆隆双链DNA能获得同同等长度度的单一一单链DNA考斯质粒粒与噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）重要的噬噬菌粒载载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13辅助噬菌菌体DNA考斯质粒粒与噬菌菌粒噬菌粒（（phagemidorphasmid）重要的噬噬菌粒载载体：pBluescript体外转录录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启启动子PT3和PT7强化外源基因的的转录提取出来来的单链链DNA重组分子子在噬菌体体RNA聚合酶的的存在下，又又可实现现外源基基因的体外转转录人造