典型发酵过程动力学及模型

典型发酵过程动力学及模型第一页，共七十六页，2022年，8月28日11949年，莫诺改变了间歇培养，建立了连续培养方法，即以一定的速率不断地向混合均匀的发酵罐中供给新鲜培养基，同时等量排除发酵液，维持发酵罐中液量一定的培养方法。理论上，连续培养可使培养无限进行。连续培养中微生物所处的环境如底物和菌体浓度、比生长速率、pH等可维持稳定。因此，应用连续培养方法，使用各种限制性培养技术，可以建立高选择性的培养环境，从而为研究微生物对环境因子的响应、最佳环境条件下获得最好的培养效果提供了独特的工具和方法。第二页，共七十六页，2022年，8月28日2一、概述1、发酵的实质：生物化学反应。2、发酵过程动力学主要研究各种环境因素与微生物代谢活动间的相互作用随时间而变化的规律。3、研究方法采用数学模型定量描述发酵过程中影响细胞生长、基质利用和产物生成的各种因素。第三页，共七十六页，2022年，8月28日34、发酵过程的反应描述及速度概念(1)、发酵过程反应的描述

XS（底物）→

X（菌体）＋P（产物）研究发酵过程的目的发酵研究的内容：菌种的来源——找到一个好的菌种发酵过程的工艺控制——最大限度发挥菌种的潜力第四页，共七十六页，2022年，8月28日4(2)、发酵过程反应速度的描述

XS（底物）→

X（菌体）＋P（产物）基质的消耗速度：(g·L-1·s-1)基质的消耗比速：(h-1、s-1)单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物(菌体)的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。第五页，共七十六页，2022年，8月28日55、发酵反应动力学的研究内容研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联反应动力学模型反应器特性+反应器的操作模型操作条件与反应结果的关系，定量地控制反应过程获取最大效益第六页，共七十六页，2022年，8月28日66、已建立动力学模型的类型

机制模型：根据反应机制建立几乎没有

现象模型（经验模型）：目前大多数模型

能定量地描述发酵过程

能反映主要因素的影响第七页，共七十六页，2022年，8月28日二、分批发酵动力学微生物发酵有三种方式：即分批发酵(batchfermentation)；补料分批发酵(fedbatchfermentation)；连续发酸(continuousfermentation)；第八页，共七十六页，2022年，8月28日8工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。其中补料分批发酵已被广泛采用，因为它的技术介于分批发酵和连续发酵之间、兼有两者的优点，又克服了它们的缺点。(见p130)各种不同发酵方式菌体代谢变化也不相同，但为了了解其基本变化，仍以分批发酵为基础来说明其代谢规律。第九页，共七十六页，2022年，8月28日9发酵中的菌体、基质和产物三者变化的基本过程是：菌体进入发酵罐后就开始生长、繁殖，直达一定的菌体浓度。其生长过程仍显示适应(停滞)期、对数生长期、静止(稳定)期和衰亡期等生长史的特征。第十页，共七十六页，2022年，8月28日10但在发酵过程中、即使同一菌种、由于菌体的生理状态与培养条件的不同，各个别期时间长短也不尽相同：如适应期的长短就随培养条件而有所不同，并与接种菌的生理状态有关。对数生长期的菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中，就不会出现适应期，仍以对数生长期的方式继续繁殖下去。另外，用静止期以后的菌体接种，即使接种的菌体全部能够生长，也要出现适应期，因此，工业发酵中往往要接入处于对数生长期(特别是中期)的菌体，以尽量缩短适应期。第十一页，共七十六页，2022年，8月28日11为了获得代谢产物，菌体尚未达到衰退期即行放罐处理；由于菌体生长繁殖和产物的形成，基质(如葡萄糖)浓度的变化一般是随发酵时间的延长而不断下降，溶解氧浓度也随发酵过程变化而发生变化。初级代谢产物由于没有明显的产物形成期．所以它是随菌体生长在不断地进行的，有的与菌体生长成平行关系，如乳酸、醋酸、氨基酸和核酸等。第十二页，共七十六页，2022年，8月28日12分批发酵中，微生物处于连续变化的环境中，基质不断消耗，产物不断积累，环境条件不断变化，菌体不能长期处于旺盛的发酵期，发酵设备利用率低，单位体积时间的产物量也较少。第十三页，共七十六页，2022年，8月28日13连续发酵中，微生物的生长代谢活动保持旺盛的稳定状态，而pH、营养成分、溶解氧等都保持恒定，并从系统外部予以调控。这样就大大提高了设备利用率。与分批发酵相比较，连续发酵具有单位产量的反应器容积小，人工费用低，产品质量稳定及发应速率容易控制的优点。第十四页，共七十六页，2022年，8月28日14尽管连续发酵具有上述优点，但是在实际发酵工业中，连续发酵还未能全部代替传统的间歇发酵。?①在连续发酵试验和生产中，遇到了在长期连续发酵过程中，微生物的突变和杂菌污染的问题，欲保持长期的无菌状态，在技术上尚有一定的困难；②发酵液在连续流动过程中的不均匀性和丝状菌在管道中流动的困难，以及对微生物动态方面的活动规律还缺乏足够的认识。目前还不能根据连续发酵的理论完全来控制和指导生产。第十五页，共七十六页，2022年，8月28日15虽然如此，连续发酵的优越性依旧不可忽视，特别是在连续发酵稳定状态条件下，根据微生物生长和代谢之间某些数学关系来采用它作为过程运转和控制的基础，从而来选定过程控制的参数。运用目前连续发酵的基本理论，人们可以人为地来控制微生物的定向培养，进而来研究微生物的生理及代谢作用。这些均是控制发酵过程中极为重要的问题。第十六页，共七十六页，2022年，8月28日16微生物生长动力学细胞反应过程包括：细胞的生长、基质的消耗和代谢产物的生成。细胞的生长繁殖过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内和胞外的物质交换，具有多相、多组分、非线性的特点。细胞的培养和代谢是一个复杂的群体生命活动，伴随着每个细胞的生长、成熟、衰老，以及退化、变异等等。因此，合理简化，构建数学模型方能进行工程应用。第十七页，共七十六页，2022年，8月28日17(一)、对微生物生长过程描述见p107

对细胞群体进行描述，而不是对单一细胞；不考虑细胞间的差别；将细胞视为单一组成，不考虑环境对细胞组成的影响（非结构模型）或考虑环境对细胞组成的影响（结构模型）认为细胞生长过程中，各组分以相同比例增加，即细胞均衡生长；将细胞视为单独的生物相（分离化模型）或将细胞与培养视为同一相（均一化模型）；第十八页，共七十六页，2022年，8月28日18几个基本概念次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等，这一类化合物称为次级代谢产物。初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级代谢产物。第十九页，共七十六页，2022年，8月28日19几个基本概念得率系数：可用于对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价。对底物的细胞得率——YX/S（g/g）生成细胞的质量与消耗底物的质量之比对氧的细胞得率——YX/O（g/g）生成细胞的质量与消耗氧的质量之比对碳的细胞得率——YC一定小于1，一般在之间，仅考虑基质与细胞的共同项碳，比YX/S更为合理第二十页，共七十六页，2022年，8月28日20呼吸商（RespiratoryQuotient简称RQ）又称气体交换率，指生物体在同一时间内，释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或摩尔数之比，即指呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子比。第二十一页，共七十六页，2022年，8月28日21（二）、分批培养微生物生长动力学时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：指数生长期:减速期:静止期：;衰亡期:倍增时间：第二十二页，共七十六页，2022年，8月28日22指数期：减速期：静止期：Kd：细胞死亡速率常数衰亡期：第二十三页，共七十六页，2022年，8月28日23(三)、无抑制、单一限制性基质下的细胞生长动力学(Monod方程)细胞生长速率是底物浓度的函数细胞生长速率与单一限制性底物浓度的关系Ks：微生物对底物的半饱和常数，与亲和力成反比，g/LMonod方程第二十四页，共七十六页，2022年，8月28日24Monod研究了基质浓度与生长速度的关系———Monod方程(1949)μ米氏方程:微生物生长是细胞群体生命活动得综合表现，机理非常复杂,实验现象的总结酶反应机制推导第二十五页，共七十六页，2022年，8月28日

μ：菌体的生长比速

S：限制性基质浓度

Ks：半饱和常数μmax:最大比生长速度μ单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。第二十六页，共七十六页，2022年，8月28日上式中μmax称为最大比生长速率，是在S>>KS，且其他成分保持不变的情况下取得的。S

是限制性底物浓度。当μ＝1/2μmax时，有KS=S，所以，莫诺常数（或称半饱和常数）KS代表当微生物的生长速率等于最大比生长速率的一半时的底物浓度；KS表示微生物对底物的亲和力。当S→∞时，μ→μm，说明μm只是理论上的最大生长潜力，实际上是不可能达到的。第二十七页，共七十六页，2022年，8月28日实际上，Monod方程是在如下假设基础上建立起来的：1）菌体生长为均衡型非结构式生长，因此，细胞成分只需要一个参数即菌体浓度表示即可。2）培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其他营养成分不影响微生物生长。3）将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。第二十八页，共七十六页，2022年，8月28日28(1)当了限制性基质的浓度很低时，即ρs<<

Ks，提高基质浓度可明显提高细胞的生长速率(2)当ρs>>Ks，细胞的生长速率与基质浓度无关(3)当处于以上两种情况时第二十九页，共七十六页，2022年，8月28日29μρs浓度低时ρsρs

浓度增加到对生长无限制时细胞生长速率与限制性底物浓度的关系ρxρx,Optrxrmaxrx—ρx关系曲线Monod方程仅适用于生长较慢的细胞，此时细胞的生长才与基质浓度呈简单的线性关系。第三十页，共七十六页，2022年，8月28日30Monod方程求解方法斜率=1/μmax截距=Ks/μmax第三十一页，共七十六页，2022年，8月28日31在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l)63364153221μ(h-1)0.060.240.430.660.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，Ks和td?将数据整理：S/μ100137.5192.5231.8311.3S63364153221第三十二页，共七十六页，2022年，8月28日32μmax，＝1.11(h-1);Ks＝97.6mg/ltd＝ln2/μmax＝0.64h第三十三页，共七十六页，2022年，8月28日33例题1.一发酵罐基质浓度为225g/L，细胞浓度0.15g/L，dX/dt=1.5g/h,当基质浓度为175g/L，细胞浓度为0.1g/L，此时，dX/dt=0.875g/h,若细胞生长可用Monod方程描述，求动力学参数μmax、Ks？第三十四页，共七十六页，2022年，8月28日34解：已知

S1=225g/L

X1=0.15g/L

dX/dt=1.5g/h,S2=175g/LX2=0.1g/LdX/dt=0.875g/h,由Monod方程：第三十五页，共七十六页，2022年，8月28日35得：μmax=20h-1Ks=225g/L第三十六页，共七十六页，2022年，8月28日362.已知发酵罐内细胞总浓度为400g/m3

，此时细胞浓度随时间变化率为0.02g/Lh，则求（1）细胞比生长速率μ;（2）若此时细胞处于对数生长期，细胞数量倍增时间td

。第三十七页，共七十六页，2022年，8月28日37解：已知：X=400g/m3，dX/dt=0.02g/Lh(1)由h-1(2)td=ln2/μ＝0.693/0.05=13.86h第三十八页，共七十六页，2022年，8月28日38代谢产物生成动力学1、Gaden对发酵的三分类与Pirt方程(a)相关模型（一类发酵）

产物的生成与细胞的生长相关的过程。产物的生成是细胞能量代谢的结果。xpxptP120图6-9第三十九页，共七十六页，2022年，8月28日39(b)部分相关模型（二类发酵）

产物的生成与基质的消耗仅有间接的关系。产物的生成是细胞能量代谢的间接结果。xpxptLuedeking-Piret方程第四十页，共七十六页，2022年，8月28日40(b)非相关模型（三类发酵）

产物的生成与细胞的生长无直接的关系。此模型中的产生多是次生代谢产物，在细胞的生长阶段没有产生累积。xpt第四十一页，共七十六页，2022年，8月28日41Pirt方程

π＝a+bμ

a=0、b≠0：可表示一类发酵

a≠0、b=0：可表示二类发酵

a≠0、b≠0：可表示三类发酵第四十二页，共七十六页，2022年，8月28日42基质消耗动力学SS1

菌体S2

产物S3

维持

XS（底物）─→

X（菌体）＋P（产物）+维持维持消耗(m)：指维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。第四十三页，共七十六页，2022年，8月28日431、基质的消耗速率与比消耗速率见p118如果基质仅用于细胞的生长：

如果以氧的消耗来计算：第四十四页，共七十六页，2022年，8月28日442、包括维持代谢的基质消耗动力学要消耗额外的基质产生能量供维持代谢待续进行。m：维持系数g/g·gY*X/S：生成细胞的干重与完全消耗于细胞生长的基质的质量之比，表示在无维持细胞代谢时的细胞得率，可称为最大细胞得率第四十五页，共七十六页，2022年，8月28日453、包括产物生成的基质消耗动力学见p119(1)产物的生成以产能途径进行；如生产ATP、酒精、乳酸等(2)产物的生成不与或仅部分与能量代谢相关联。基质消耗速度取决于:(1)细胞生长速率；(2)产物生物速率；(3)基质消耗用于维持能速率。第四十六页，共七十六页，2022年，8月28日46细胞反应动力学模型的建立细胞反应过程数学模型是一组可以近似描述或表示细胞反应过程的数学方程式，可以在一定程度上精炼出原过程的特征。①预测微生物反应过程的进程，成为预测模型。②数学模拟放大。可以省去中试阶段，降低费用。缩短开发期。③过程优化策略。通过计算机仿真，求出各种条件下生成装置的各种行为，寻找最优生成条件，实现生成的最佳操作。④过程优化控制。按照数学模型，求解控制变量的最优值，保证反应某个指标、产品质量或能量消耗处于最佳值。第四十七页，共七十六页，2022年，8月28日47生化工程中，大致有三种模型：

数字拟合型：完全依赖于实验，根据实验数据进行回归分析建立一个能够描述变量外部联系的数学模型

机制模型：建立在反应机制基础之上。

常规模型：以实验为依据，在模型的数学表达式上对有近似特性的机制模型加以模拟，形式虽然与被模拟的机制模型相似，但模型参数的本质不完全相同。第四十八页，共七十六页，2022年，8月28日48一、数学拟合型模型黑箱系统+经验模型。不需要了解内部机制，模型值直接应用于生成过程，可靠性较高，但不能找到反应过程的本质。

获取数据的途径：

(a)在正常生产操作中获得实测数据；

(b)实验设计获得实测数据。例子：(1)紫外线照射菌体悬浮液与细胞存活率关系P123(2)超声波降解透明质酸的时间与透明质酸相对分子时的关系P124第四十九页，共七十六页，2022年，8月28日49二、机制模型“白箱”系统要求：(1)对内在机制有深刻的认识；(2)精确、可靠的基础数据。无条件限制下的微生物种群生长P125第五十页，共七十六页，2022年，8月28日50三、常规细胞反应动力学模型机制分析Y=f(x1,x2,…,xn)

获取数据

模型参数估计兽疫链球菌分批发酵过程动力学模型推导P126龙格库塔法：“灰箱”系统第五十一页，共七十六页，2022年，8月28日51补料分批发酵过程动力学补料分批发酵介于分批培养与连续培养之间，在发酵的过程中连续或间歇的补加一种或一种以上特定限制性底物，直到反应结束后才排出培养液的操作方式。第五十二页，共七十六页，2022年，8月28日52

补料分批培养主要适用于代谢产物得率或生成速率受底物影响、细胞的生长状况和培养环境需要调节的过程：P130细胞的高密度培养过程所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制作用存在Crabtree效应营养缺陷型菌株的培养受异化代谢阻遏的系统高粘度的培养系统第五十三页，共七十六页，2022年，8月28日53Crabtree效应Crabtree效应：在酵母培养中，当糖浓度过高，即使溶解氧很充足，酵母菌也会将糖分解成乙醇，从而使菌体得率下降的现象。Crabtree(1929)发现，面包酵母的呼吸活力对游离的葡萄糖十分敏感，当其浓度在5μg/L时即出现阻遏作用。为获得最大酵母得率，不能用恒速流加的方法，而保持最大生长速率的变速流加法只是理想状态。第五十四页，共七十六页，2022年，8月28日54补料分批发酵过程动力学模型状态变量：表示在任何反应时间上反应情况的一组相互依赖的变量及其数值。

pH、温度、细胞浓度、底物及产物浓度过程参数：包括细胞的生长速率、得率系数、氧及二氧化碳的传递系数。操作变量：包括加料速率、加料中的底物浓度、搅拌速度及通气速率等。第五十五页，共七十六页，2022年，8月28日55补料分批发酵的状态方程状态方程与质量平衡与能量平衡有关，因此推导状态方程时要采用平衡关系。推导过程P132恒速流加操作模型P133恒定生长参数的流加模型P134定值控制的流加模型P136第五十六页，共七十六页，2022年，8月28日56连续发酵过程动力学1870年克赫创建的纯种培养技术与1933年克雷文创建的三角瓶震荡液体培养方法为工业化利用微生物技术开辟了新的途径。现代发酵工业中，绝大多数培养均采用纯种液体培养，操作方法主要是间歇培养、连续培养和流加培养。特别是1949年创建的连续培养，保持培养的稳定状态，并能维持较长时间，为研究微生物对环境的响应，寻找培养的最佳条件提供了独特的研究方法，也成为连续生产细胞和其他产物一种极好的培养方法。第五十七页，共七十六页，2022年，8月28日57连续发酵过程指以一定的速度向反应器中流加新鲜培养基，同时以相同的速度排出培养液，因而反应器内的液量维持恒定。纯培养的连续操作主要采用CSTR，根据达到稳定状态的方式不同，CSTR有两种类型：恒化器和恒浊器恒化器无反馈控制机构，以恒定不变的流量供给培养基，通过细胞自身的催化性质达到稳定的操作状态恒浊器有反馈控制机构，通过控制培养基的流加速率，使反应器内的细胞浓度保持恒定。恒浊器较难控制，多采用恒化器进行连续培养。第五十八页，共七十六页，2022年，8月28日58优点：细胞生长速度、代谢活动处于恒定状态，能够高速稳定的大量生产，生产效率高，劳动成本低，产品质量稳定;缺点:(1)开放式操作导致容易染菌；(2)有些细胞得不到更新，容易退化变异。连续反应器的特点第五十九页，共七十六页，2022年，8月28日59恒化器及其操作特征所谓恒化器，是指具有恒定化学环境的反应器，恒化指明了操作的稳定状态特征。恒化器的基本操作模式如下图。第六十页，共七十六页，2022年，8月28日60物料连续地以体积流量F流入反应器,并以同样流量流出去。流入物流中基质浓度为S0,菌浓度为x0。x0一般为0,反应器内有很好的混合,即各点浓度一样。恒化器的操作特点是其流出物流的浓度与反应器内相同，而且加入的物流一进入反应器立即与反应器内物料均匀混合。第六十一页，共七十六页，2022年，8月28日61对于菌体：积累的细胞＝（进入-流出）的细胞+（生长-死亡）的细胞从物料衡算关系可以作出菌体的平衡关系：比死亡速率比生长速率第六十二页，共七十六页，2022年，8月28日若①流入反应器的菌体浓度x0为零；②μ＞＞ε；③培养液体积不变；所以，F/V实际上是表示单位体积培养液的流率，用稀释率D来描述，表示反应器中物料更新程度，是连续培养中的一个重要的参数;稀释速率的倒数就是物料在反应器中的平均停留时间。第六十三页，共七十六页，2022年，8月28日开始连续培养一段时间(大约是平均停留时间的3-5倍)以后，微生物反应过程进入稳态，培养液中的细胞、基质和产物浓度恒定，不再随培养时间变化，这就是恒化培养。达到稳态时：第六十四页，共七十六页，2022年，8月28日对于恒化器而言，因菌体浓度处于恒定状态，所以：这表明，在一定范围内，人为地调节培养基的流加速度，可以使细胞按照所希望的比生长速率来生长。第六十五页，共七十六页，2022年，8月28日对于限制性底物：积累底物＝（流进-流出）-（生长+产物+维持）所消耗的底物第六十六页，共七十六页，2022年，8月28日产物形成量很小，可以忽略，这样，在恒定状态下第六十七页，共七十六页，2022年，8月28日对于产物形成过程中的平衡：积累的产物＝（生成-流出）的产物同样道理，在恒定条件下：第六十八页，共七十六页，2022年，8月28日连续培养中，变量很多，如x、s、D及μ等，但这些变量中D是最基本的变量，这不仅因为D可以通过加料量F而任意调节，更重要的D一旦变化，就会引起x、s、μ等一系