第二章基因工程制药

基因工程制药基因工程制药GeneEngineeringforPharmaceutics（三）基因工程制药1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。2、宿主细胞的分类：①原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。知识回顾基因工程制药3、影响外源基因在E.coli表达的因素：（1）外源基因的剂量（2）外源基因的表达效率（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件知识回顾基因工程制药4、真核基因在大肠杆菌中的表达形式:⑴以融合蛋白的形式表达药物基因⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因⑶分泌型表达药物基因

知识回顾基因工程制药学习内容基因工程菌的不稳定性基因工程菌的培养基因工程制药2.5基因工程菌的不稳定性及对策基因工程菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件；基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。基因工程制药质粒plasmid

是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。2.5.1

质粒的不稳定性基因工程制药2.5.1

质粒的不稳定性分类：分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。基因工程制药质粒分裂不稳定的原因⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；⑵这两种菌比数率差异的大小。质粒结构不稳定的原因⑴质粒自发缺失与质粒中的短正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；⑵无同源性的两个位点之间也发生缺失；⑵培养条件。2.5.1

质粒的不稳定性基因工程制药质粒稳定性(stability)的分析方法样品不含抗性标记抗生素

平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基

10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值

(稳定性stability)基因工程制药2.5.2提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌选择合适的载体选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化基因工程制药

宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。提高质粒稳定性的方法基因工程制药

含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较大，因而对这类工程菌增加质粒考贝数能提高质粒的稳定性；对同一工程菌来说，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的考贝数。提高质粒稳定性的方法基因工程制药

菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。生长数率/h0.20.4质粒拷贝数10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的连续养3提高质粒稳定性的方法基因工程制药

选择压力：

1）抗生素抗性基因：在培养基中加选择性压力如抗生素等，是工程菌增养中提高质粒稳定性常用的方法。

2）营养缺陷型宿主菌提高质粒稳定性的方法基因工程制药

外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定。由于外源基因高效表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制。第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。

提高质粒稳定性的方法基因工程制药工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大。培养条件的变化对大肠杆菌的比生长速率有很大的影响，而基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性也有很大影响，提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。提高质粒稳定性的方法基因工程制药固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性。基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都有了很大提高。提高质粒稳定性的方法基因工程制药2.7

基因工程菌的培养培养工艺是发酵工艺的重要组成部分，对外源蛋白的表达至关重要，直接影响产品的产量和质量，从而影响产品成本及市场竞争力。最佳的培养工艺还要考虑对纯化工艺的影响。基因工程制药基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。比生长速率:菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。基因工程制药大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。基因工程制药Viewpoint1:能量的供应决定了菌体的最大比生长速率。Viewpoint2:小分子前体和催化组分（RNA聚合酶，核糖体等）的限制决定了菌体的最大比生长速率。菌体生长调控的观点A、菌体的生长与能量的关系

B、菌体生长与前体供应的关系基因工程制药

碳源物质是组成培养基的主要成分。

碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用A、菌体的生长与能量的关系基因工程制药分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。基因工程制药B、菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体蛋白合成增加，比生长率提高。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，其质粒对工程菌的生长影响不大。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝），生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。基因工程制药严紧反应

stringentresponse;stringentcontrol

是指当细菌在缺乏合成蛋白质所必须的氨基酸时，停止合成核糖体RNA的反应。基因工程制药基因工程菌的培养分批培养补料分批培养连续培养透析培养固定化培养培养方式基因工程制药补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。补料分批培养基因工程制药连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。连续培养基因工程制药透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。透析培养基因工程制药基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。固定化培养基因工程制药选择培养方式必须考虑的因素1、培养基2、溶解氧3、温度4、pH5、蛋白表达相关因素－表达时机、表达程序等基因工程制药基因工程菌的培养设备基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要