DNA的提取方法简介

会计学1DNA的提取方法简介第1页/共17页第2页/共17页1、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

第3页/共17页

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。第4页/共17页细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

2.细胞的破碎第5页/共17页由于高等动物DNA主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：①破碎细胞难；从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。第6页/共17页3.DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.第7页/共17页（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.第8页/共17页（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.第9页/共17页二.从猪脾中提取DNA第10页/共17页1.操作步骤:取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。按睥：1×SSC=1;5W/V加入50ml预冷的1×SSC，用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀，离心，弃上清，重复2次。将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿—异戊醇，激烈振荡20分钟，4000r离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。第11页/共17页2.实验材料，仪器和试剂：（1）

实验材料：新鲜猪脾：（2）仪器：量筒：1×10、3×100烧杯：2×100，2×250；磨口锥形瓶：1×250、1×500；吸管：1×1、1×10；滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。（3）

试剂：①

20×SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸钠•2H2O，PH=7.0加水至1000ml；②

1×SSC，0.1×SSC由①做相应的稀释得来；③

NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3.72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中，用固体NaOH调PH=8后定容至1000；④

5%SDS（W/V）：6gSDS溶于100ml45%乙醇中；⑤

氯仿-异戊醇=24：1（体积比）⑥其他:95%乙醇，盐冰.数据:DNA重,产率:

待测液中测得的核酸μg数DNA%=×100

待测液中制品的μg数第12页/共17页二苯胺显色法测定DNA含量强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。第13页/共17页１、二苯胺试剂：使用前称取0.8g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180ml冰乙酸中，再加入8ml过氯酸（60%以上），混匀待用，临用前加入0.8ml1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。每组需56ml共需2800ml２、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01NNAOH配成200微克／毫升的标准液。每组需12ml共需600ml３、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。共需70ml４、(测样品液：准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克／毫升的溶液。每组需4ml

共需200ml第14页/共17页操作方法：

1.DNA标准曲线的制定：

取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。另取2只试管，各加2ml蒸馏水作为对照。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.制品的测定：

取2支试管，各加2ml待测