大四上学期-实验诊断10基因

第十章其他检测

第一节基因诊断

讲授内容及要求

一、基因诊断的基本概念二、基因诊断的基本技术三、基因诊断的应用

四、基因治疗:概念、方式、程序、应用

第一节基因诊断基本概念和流程

传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断.表型的改变是由基因异常造成的

基因的改变是引起疾病的根本原因一基因和基因诊断的概念1.基因是携带有遗传信息的DNA片段。蛋白质是生命活动的物质基础，蛋白质是基因的表达产物。2.利用分子生物学的原理和实验技术，以探查导致相关疾病发生和发展的DNA结构变异为中心内容的诊断疾病的技术和方法称为基因诊断。DNA诊断RNA诊断

染色体=DNA(螺旋折叠后)+蛋白质

基因=染色体上有遗传效应的片段,也就是说,不是染色体上所有的部分都叫基因,只有一些说通俗点"有用的"部分才叫基因,这个"有用"就是所说的能够翻译成蛋白质.

基因诊断主要是对遗传物质（DNA\RNA）结构、表达量进行检测，是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义基因变异的多样性1.遗传疾病的致病基因和易患基因都是相应的正常基因突变产生的。2.染色体的结构与数目，如由于21号染色体增多(三倍体)导致的先天愚型。3.基因缺失，如α地中海贫血。4.基因片段的插入与缺失5.基因点突变：同义突变，错义突变，无义突变，移码突变，终止密码突变和非编码区的突变等等。

基因诊断的内容

内容评价基因突变的检测点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等基因突变检测基因连锁分析一些疾病的致病基因尚不清楚基因表达的分析mRNA定量检测及mRNA长度分析病原体诊断外来入侵病原微生物遗传物质的检测

二、基因诊断的特点针对性强：以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断”。

特异性高：以分子杂交技术为基本原理

灵敏度高：基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的单碱基改变。而且待测标本微量。

早期诊断：基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可在产前早期诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜伏期的病原微生物、还可预测和早期发现某些恶性肿瘤。适应性强：基因探针可为任何来源，任何种类，探针序列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广。

PCR、SSCP限制性片段长度多态性分析(RFLP)DNA序列测定DNA芯片技术核酸分子杂交第二节基因诊断的基本技术第二节基因诊断的基本技术

1.基于核酸杂交的基因探针，等位基因特异性寡核苷酸探针（Allelespeceficoligonucleotide,ASO)，基因芯片等。2.基于核酸杂交与电泳的技术，如Southernblot和Northernblot等等。3.基于PCR和电泳技术的PCR-RFLP和PCR-SSCP等。4.基于电泳和免疫技术的免疫印迹（Westernblot)

（一）、核酸分子杂交（hybridization）

这是应用最广泛的一类基因诊断技术

根据碱基互补配对原则，将样品DNA/RNA双链经变性处理，加入已标记的单链DNA/RNA探针，样品中与探针互补的DNA/RNA序列可与探针形成杂交双链DNA，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段。

分子杂交技术过程☆探针制备及标记（同位素或非同位素）☆待测核酸样品制备（分离，纯化）☆杂交（液相，固相）☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）☆显示结果（显色，发光，放射自显影）☆结果分析分子杂交的基本方法

原位杂交(ISH)斑点印迹杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交

1、原位杂交

(Insituhybridization，ISH)原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。现今原位杂交技术的应用越来越广泛.

不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探针杂交。

可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。原位杂交技术分类

1、基因组原位杂交(Genomeinsituhybridization，GISH)技术2、荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)

荧光原位杂交技术利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。3、多彩色荧光原位杂交技术4、原位PCR

2、斑点印迹杂交

把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与标记核酸探针杂交。通过纤维素膜杂交斑点的放射自显影或胶片斑点的光吸收值扫描可以测定待检核酸的含量。可检测特定基因的存在或表达情况。

3、Southern印迹杂交

1975年，英国Southern创建

概念:将制备的DNA经酶切电泳、再转印到固相支持物上，用探针杂交后进行检测的方法，用于

DNA/DNA杂交。该方法主要用于检测基因组中待测的基因或序列4、Northern印迹杂交Northern印迹杂交（Northernblot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交.4、Northern印迹杂交

检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳Northern印迹杂交主要用于观测各种基因转录产物的大小、转录量以及转录产物特性分析。总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色DNA测序

DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

在基础生物学研究中，和在众多的应用领域，如诊断，生物技术，法医生物学，生物系统学中，DNA序列知识已成为不可缺少的知识。具有现代的DNA测序技术的快速测序速度已经有助于达到测序完整的DNA序列，或多种类型的基因组测序和生命物种，包括人类基因组和其他许多动物，植物和微生物物种的完整DNA序列。(三)聚合酶链式反应（PCR）

PCR：一种体外基因扩增技术，对目的基因组DNA的信号进行放大的生物学技术。它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段PCR的原理PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。PCR扩增产物电泳通过PCR能扩增出所需的特异性条带PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA特点：特异性引物引物

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。PCR的类型和应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……病原体核酸的检测——RealtimePCR实时荧光定量PCR：通过起始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现核酸定量的一种技术。广泛应用于结核和麻风分枝杆菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒的检查在常规PCR基础上，添加了一条标记2个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的5‘端，称为荧光报告基团（R）；另一个标记在探针的3’端，称为荧光抑制基团（淬灭基团Q）。探针的3‘羟基（-OH）已被去除或封闭，不具有延伸能力。在探针分子完整的情况下，R发出的荧光被Q淬灭吸收。此时检测不到荧光信号。当特异性PCR扩增发生时，探针会在PCR过程中被Taq酶的5’--3‘外切酶活性作用切断，释放出R基团,Q的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的产生,荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

。荧光信号伴随PCR产物的增长而增长目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝大部分是此类。

实时荧光定量PCRRT-PCR

反转录·聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。（三）、限制性片段长度多态性（RFLP）:

限制性核酸内切酶能够识别特定的DNA序列，并在其中的某一特定碱基位点（限制性位点）将DNA切断，使

DNA形成限制性片段.粘性切口平端切口

PCR-RFLP1.目的基因的扩增2.扩增片段的酶切3.酶切产物的电泳4.多态性（突变）的确定RFLP技术珍断疾病的机理:由于基因突变的结果,使DNA上原有的核酸内切酶的识别序列发生改变,导致使用限制酶去切割时得到的结果与不发生突变的结果完全不同,可借此做出诊断.如:某些遗传性疾病发生特异的点突变,而点突变位置正好是某些酶的识别和切割点,可用酶切方法做出诊断.RFLP的主要步骤

DNA→酶切→Southern杂交分析DNA→PCR→酶切→电泳分析

RFLP主要有以下两种类型：

点多态性序列多态性点多态性

表现为DNA链中发生单碱基突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。这类多态性实际是双态的，即有或无酶切位点。据此，样品DNA经特定内切酶消化或Southern印迹杂交即可诊断某些疾病。2.序列多态性

DNA链内发生较大片段的缺失、重复、插入等变异。结果，内切酶位点本身碱基序列虽未改变，但原有内切酶位点在基因组中的相对位置改变了从而导致RFLP。也可用Southern印迹杂交诊断相关疾病。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)

主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致

基因芯片(Genechip,DNAchip),又称为DNA微阵列(DNAMicroarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将已知DNA片段或cDNA片段作为探针，紧密有序地排列固定于支持物（多聚赖氨酸硅胶）上，然后与荧光标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息。（四）、基因芯片

基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern

、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。

基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。

基因芯片或微阵列是近年发展起来的分子生物学研究工具。在

1平方厘米的芯片上可以同时分析几百至数万个基因，具有高通量、快速获取有关生物学信息的特点。目前基因芯片主要用于科研，要从实验室研究推向临床应用还有一系列问题需要解决。如提高特异性、简化操作、降低成本等。意义灵敏度高，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。适用于核酸变异的病原微生物，如病毒第三节基因诊断的应用一、遗传性疾病的诊断二、感染性疾病基因诊断三、肿瘤的基因诊断四、基因诊断在法医学中的应用镰状细胞贫血的基因诊断一、遗传性疾病的诊断

血红蛋白(hemoglobin,Hb)镰刀形红细胞贫血

（sicklecellanemia）

分子病--镰刀状红细胞性贫血成人血红蛋白为α2β2镰刀状红细胞性贫血的病因是

β链结构异常(GAG→GTG)

1234567HbAN--Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-HbsN--Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-镰状细胞贫血的基因诊断ProGluGluCCTGAGGAGHbAProValGluCCTGTGGAGHbSMstIIMstIIMstIICCTNAGG1.1kb0.2kbMstIIMstII1.3kb567HbA:2053bp点突变,发生在限制性内切酶位点上Southernblot检测镰状细胞贫血制备血液DNAMstII消化琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜与标记的珠蛋白DNA杂交放射自显影PCR扩增检测PCR扩增珠蛋白基因MstII消化琼脂糖电泳EB染色

纯合子杂合子1.3Kb1.1Kb镰状细胞贫血症患者的血样本DNA经MstII（识别序列CCTGAGG）酶切后电泳检测。294191103bpSSAAASPCR扩增检测结果二、感染性疾病基因诊断

感染性疾病由病原微生物引起，致病的病原微生物主要有病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等。这些病原体的传统检测方法通常采用形态学检查，体外培养和免疫学试验。但对某些难以培养的病原体，抗原抗体检测不能判断体内病原体DNA或RNA的复制情况，或存在检测灵敏度低等问题。自聚合酶链反应（PCR）技术问世以来，基因诊断技术作为病原体检测的新方法得到突飞猛进的发展实时荧光定量PCR（RealTimeFlourescencequantitativePCR,FQ—PCR）病原体基因诊断的主要技术方法目前病原体基因诊断在临床上最大的用途是1.检测难于培养的病原体2.在治疗中检测病毒载量以评价疗效3.治疗过程中检测耐药基因突变4.用于血液筛查5.用基因分型方法进行病原体种群分类。已通过国家药品食品监督管理局（SFDA）审批的基因诊断试剂序号试剂盒名称

1乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒2乙肝病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒

丙肝病毒（HCV）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒结核分支杆菌（TB）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒沙眼衣原体（CT）核酸扩增（PCR）—荧光检测试剂盒6沙眼衣原体和淋球菌（CT&NG）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒7人乳头瘤病毒（HPV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒

8人类免疫缺陷病毒（HIV—1）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒9新型冠状病毒（SARS）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒10神经管畸形基因检测（PCR—RFLP）试剂盒11地中海贫血基因检测试剂盒（基因芯片法)

拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象。使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为15-32%、38%、49%、66%。因此，服药前期及服药期间监测YMDD的变化及HBVDNA含量就显得十分重要。拉米夫定耐药的主要原因是病毒多聚酶基因的YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）区域发生突变，即由YMDD突变为YIDD或YVDD，从而产生耐药。蛋氨酸突变为异亮氨酸Ⅰ或缬氨酸Ⅴ，从而降低了拉米夫定的亲和力，减弱拉米夫定对突变病毒复制的抑制能力1、提高自动化程度。从标本预处理、核酸提取到基因扩增和产物检测都有望实现自动化，可将人为误差降到最小，提高检测的精确度，提高工作效率。2、测定方法和工作程序的标准化。通过标准化改善实验室测定准确度，从而提高不同实验室间结果的可比性。3、在严密设计的临床应用研究基础上，确定每一个基因诊断项目适用的范围，避免滥用造成的困扰和不必要的费用。4、开发更加快捷廉价的检测方法病原体基因诊断的发展趋势三、肿瘤的基因诊断肿瘤相关基因包括癌基因、原癌基因、肿瘤抑制基因、肿瘤转移相关基因、肿瘤耐药基因四、基因诊断在法医学中的应用法医学中对生物样本检测的主要目的是达到个人识别和亲子鉴定80年代以来，以核酸分子杂交和PCR技术为核心的基因诊断学的迅速发展，有逐渐取代传统法医物证鉴别法的趋势法医学基因诊断的分子基础是基于人类基因组结构中存在一些可作为个体特征标示的序列,即可变串连重复序列（小卫星DNA）的多态性三.基因诊断在法医学中的应用DNA指纹技术：遗传基础是DNA的多态性个体特征标志的序列建立于1985年Humangenome:3.3billionbpwith<40000genes1.1%:exons;(Codingregion)))24%introns,75%intergenicNoncodingGenome:1、

Codingregion(编码区)：<5%inhumangenome(1.5%).2.

Noncoding(非编码)DNA:introns(内含子),tandemlyrepeated(串连重复)sequences(e.g.satelliteDNA)orinterspersedrepeats分散重复(e.g.Aluelement).可变串联重复序列（variablenumberoftantemrepeatVNTR)5’–ATAAACTATAAACTATAAACT–3’3’–TATTTGATATTTGATATTTGA–5’n（核心序列）Satellitescomprisemorethan40%ofthegenome小卫星DNA核心序列长10-70bp，主要分布于基因组的非编码区。不同个体重复次数相差悬殊，因而长度变化较大，呈现多态性。可以用来鉴别个体(小卫星DNA)DNA指纹技术：遗传基础是DNA的多态性个体特征标志的序列建立于1985年方法:指纹图谱法:用HinfI切割染色体DNA.由于该酶在小卫星DNA的重复序列上无切点,因此电泳后在用标记的小卫星DNA做探针杂交时,不同个体出现不同的杂交带型,称为指纹图谱.至今世界上还未发现有两个人的杂交带型完全相同.不同的个体或群体有不同的DNA指纹图:英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明，两个随机个体具有完全相同的DNA指纹图的概率，为三千亿分之一(即3×10-11)。两个同胞个体具有相同图谱的概率也仅仅为二百万分之一(即2×10-6)。但同卵双胞胎的DNA指纹图完全相同。DNA指纹术的工作原理及步骤

提取DNA(样品:毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等)用限制性内切酶HinfI切割，将DNA切割成许多长度不同的小片段。对酶解完全后的DNA片段进行电泳，分离各酶切片段。先用碱性溶液使凝胶板中双链DNA片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA片段转印到尼龙膜上。让放射性核心序列探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X射线使胶片曝光，从而使杂交带显影在胶片上。

获得DNA片段条状图谱,便是所谓的DNA指纹。DNA指纹技术的原理：AnapplicationofrepeatedDNAsequencesfoundinmammaliangenomesHighlyvariablebetweenindividualsNotwopeoplearethesame,exceptidenticaltwins1．高度的特异性2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。DNA指纹的特点流式细胞术及其应用流式细胞仪常用荧光素流式细胞术介绍数据分析什么是流式细胞术？利用流式细胞仪（flowcytometry,FCM）对处在快速、直线、流动状态中的单个微粒多参数、快速定量分析，也可以同时对特定群体进行分选的技术分析对象包括细胞、细菌、荧光微球等，0.4m~40m什么是流式细胞仪？六种技术：激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术四个系统：液流系统、光学系统、电路系统、分析系统流式细胞仪构造激光源计算机分析滤光片（长通、短通、带通）包括流动室、鞘液和样本流信号检测器BDFACSCalibur双光源，488nm和633nm可同时检测四种抗原可分选（理论上）流式细胞仪检测什么信号？散射光信号前向散射光（forwardscatterlight,fsc

）反映细胞大小侧向散射光（sidescatterlight,ssc）反映细胞内部颗粒、核膜等FSC检测器SSC检测器外周血裂红后FSC/SSC分布R1:淋巴细胞R2:单核细胞R3:中性粒细胞R4:裂解碎片流式细胞仪检测什么信号？荧光信号细胞抗原抗体荧光素激光束抗原抗体反应单克隆荧光抗体标记常用荧光素不同的激光器搭配不同的荧光素，原理是激发光波长有所不同数据分析设门（gating）：根据某些特性将分析细胞群圈起来。淋巴细胞：FSC/SSCCD45++/SSCdimT淋巴细胞：CD3+/SSCdim数据分析直方图单参数分析横坐标：信号强度纵坐标：细胞数量数据分析散点图双参数分析横、纵坐标代表的均是信号强度UL:cd3-cd4+UR:cd3+cd4+LL:cd3-cd4-LR:cd3+cd4-标本染色的一般方法已开展的临床项目FCM的临床应用其他临床应用标本来源：

外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脱落细胞。血清和各类体液样本（可溶性蛋白）标本染色的一般方法前期处理CSF、BALF、胸腹水等：过滤、离心后制成单细胞悬液，并调整目标细胞浓度约106/ml骨髓、红细胞：调整样本中目标细胞浓度106/ml50～100l标本(血小板1～5l)+荧光抗体室温，避光，抗体孵育20min(胞内因子检测需置4℃)抗体孵育如果需要破坏样本中红细胞：

加入1ml红细胞裂解液避光，10min溶血离心弃上清，加入PBS，混匀后离心，弃去上清用400lPBS充悬，避光待上机。胞内抗原检测：

按照说明书加入固定剂、破膜剂及胞内荧光抗体，避光反应30~40min。胞内染色洗涤上机已开展的项目淋巴细胞亚群HLA-B27CD55、CD59检测CD34造血干细胞计数白血病和淋巴瘤免疫分型杂项（BALF、胸腹水等CD分子检测）TH1/TH2细胞检测血小板活化炎症感染指标CD64CBA网织红细胞/血小板检测微小残留病灶（MRD）肿瘤细胞倍体（DNA）细胞凋亡

……流式细胞术的临床应用其他临床应用淋巴细胞亚群试剂：BDIMK-LymphocyteKit标本：外周血（常用）检测指标：T细胞（CD3、CD4、CD8）

B细胞（CD19）

NK细胞（CD3-CD16＋56＋）已开展的项目实验室报告医生报告临床意义：体内免疫状态判断某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染

SCID、AIDS、SLE、RA急性GVHD、移植排斥、恶性肿瘤免疫球蛋白缺乏症或分泌过多结合淋巴细胞绝对数来看待百分比的改变AIDS淋巴细胞亚群HLA-B27试剂：BDHLA-B27Kit标本：外周血检测指标：T

(CD3+)淋巴细胞上HLA-B27

定性检测已开展的项目临床意义：强直性脊柱炎（高度相关）遗传性关节炎

Reiter’s综合征

反应性关节炎、银屑病关节炎

急性前葡萄膜炎、肠炎性关节炎、HLA-B27CD55、CD59试剂：CD59-FITC、CD55-PE标本：外周血（红细胞、白细胞）检测指标：CD55、CD59百分比

CD55、CD59荧光强度已开展的项目临床意义：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）酸化血清溶血试验（Ham’s试验）糖水试验蛇毒因子溶血试验补体溶血敏感实验FCM检测（金标准）CD55、CD59以红细胞检测为例normalPNH造血干细胞计数试剂：BDProcount™ProgenitorCellEnumerationKit标本：骨髓、动员后的外周血检测指标：CD34＋％及浓度已开展的项目蓝色－荧光微球（数量已知）；红色－CD34＋细胞干细胞特征：

CD45表达弱→阴性

(R2)CD34表达弱→强

(R4)DNA/RNA含量多，染色性较强(R1)大小（FSC）和颗粒度（SSC）淋巴细胞相似临床意义：血液系统疾病的造血干细胞移植

数量的检测采集时机的确定

某些肿瘤

造血干细胞计数白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型试剂：各种单克隆荧光抗体标本：骨髓、外周血、胸腹水、脑脊液、淋巴组织检测指标：我室目前开展了将近40种指标的检测可满足大部分L&L的分型要求已开展的项目分型方案：CD45设门，四色标记，临床意义：客观、快速地分析确定异常细胞系来源及分化阶段区分双克隆或双表型的HAL判断预后白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型正常骨髓细胞CD45/SSCR1:淋巴细胞R2:幼稚细胞R3:单核细胞R4:中性粒细胞R5:有核红细胞AML-M1R2占94％，表达cd33,cd34,cd117,cd71,cd13,cd64,mpoALL(B)R2占65％，表达cd79a,cd19,cd34,cd22,cd10,cd38,hla-drMMR2占17％，表达cd38(+++),ckappa轻链临床意义：结节病和特发性肺间质纤维化肺部肿瘤疾病已开展的项目肺泡灌洗液（BALF）淋巴细胞检测cd4/cd8≈5.04TH1/TH2细胞检测TH1，抗胞内病原体迟发型超敏反应、炎症

IL-2、IFN-γ、TNF-α介导细胞免疫CD4+TTH1/TH2TH2，蠕虫感染环境变应原