细胞培养技术适用版

细胞培养技术与应用

郭中敏中山大学动物实验中心概述

细胞生物学、分子生物学以及免疫学是现代三大生物科学，发展异常迅速。组织培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在培养中或机体内，细胞行为的基本规律是一样的，因此许多研究可以在体外进行。更重要的是，在培养条件下，人们可以有目的的、有选择的控制细胞生长的环境，因此可以研究在某些特殊条件下的细胞生物学行为，本讲主要目的是介绍细胞培养的基本技术及其应用。组织培养中感兴趣的研究领域

1)细胞内部的种种活动,如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢;2)细胞内部的流动,如RNA从细胞核向细胞质方向运转,激素受体复合物的易位等;3)生态学,如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用;4)细胞与细胞之间的相互作用,如胚胎诱导、细胞群体的动力学等.5)组织工程内容一、细胞培养的基本理论二、细胞培养的基本条件三、基本的细胞培养技术四、细胞培养技术的应用一、细胞培养的基本理论1、基本概念2、基本理论细胞培养技术的历史

1885年Roux最早尝试使组织离体培养,材料是鸡胚神经板,采用生理盐水为培养液,并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养。由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的两类不同细胞间的融合细胞后，为细胞融合技术的发展和应用，及杂交瘤技术奠定了基础,并推动了细胞生物学、细胞免疫学、细胞遗传学、病毒学等学科的交叉与发展。随着细胞生物学和分子生物学间的相互渗透交叉，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，在阐明基因的结构和功能、基因在细胞生长和分化中的作用，以及细胞癌变机制等方面起了重要作用。如基因的克隆及在细胞中的作用、克隆癌基因与细胞生长分化的关系，以及反义癌基因RNA对细胞转化的抑制作用的方面起了重要作用。

(见下图)1912年Carrel将无菌操作技术引入动物细胞培养，在动物体液中发现促进细胞生长的因子，奠定了无血清培养研究基础。1962年Stile成功的大规模悬浮培养了小鼠肾细胞（BHK），从而为动物细胞大规模培养技术的发展奠定了基础。1967年Wezel和1972年Knazek先后创立了微载体和空纤维细胞培养体系，使细胞培养技术提高到大规模培养水平。体外培养技术的发展大致可分三个时期：50年代之前是细胞培养在多个领域发展期；50年代是细胞培养迅猛发展期，多种培养技术相继建立；50年代后是体外培养技术与生命科学其他技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术。我国体外培养技术的发展：

20世纪50年代以后，如张钧、鲍鉴清分别在上海、北京开展部分相关工作1952鲍鉴清天津第一实验室1955编写第一本《组织培养术》1995年鄂征主编《组织培养和分子细胞学技术》一书其他还有：郭辉玉、高尚荫、鄂征、陈瑞铭等.

由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。

在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的两类不同细胞间的融合细胞后，为细胞融合技术的发展和应用，及杂交瘤技术奠定了基础,并推动了细胞生物学、细胞免疫学、细胞遗传学、病毒学等学科的交叉与发展。随着细胞生物学和分子生物学间的相互渗透交叉，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，在阐明基因的结构和功能、基因在细胞生长和分化中的作用，以及细胞癌变机制等方面起了重要作用。如基因的克隆及在细胞中的作用、克隆癌基因与细胞生长分化的关系，以及反义癌基因RNA对细胞转化的抑制作用的方面起了重要作用。基本概念

一.分类1.组织培养(TissueCulture)指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。2.细胞培养(CellCulture):培养物是单个细胞和细胞群。3.器官培养（OrganCulture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法.（如下图）组织培养的细胞生物学特点

体内外细胞的差异和分化:

体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时,细胞在体外培养后,一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响,生活在缺乏动态平衡的环境中,发生变化则是必然.细胞最多见的表现是:返祖（Atavism）现象——失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。

细胞增殖和分化是细胞生命进化中所获得的基本属性,增殖使细胞数量增多;分化使机体结构和功能多样化,最后演变成完整的有机体.培养细胞的分化

细胞分化机制是极其复杂的,是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下,众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程.不适应（Deadaption）——细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性.脱分化和去分化（Dedifferentiation）——由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后,储存肝糖元的能力丧失,并很难再现.因此,不适应和脱分化是两个不同概念，不适应只是因为生存条件改变而使分化发生抑制;从分子水平考虑,脱分化很可能是基因变异所导致.培养细胞的形态

1.贴附型：1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞4）

多形型细胞：神经组织细胞2.悬浮型：如癌细胞和血液白细胞组织培养细胞的生长和增殖

1.原代培养（PrimaryCulture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4w2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cellline）阶段（分有限和无限细胞系）。细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。二倍体细胞系（Diploidcellline）：即细胞保持二倍体核型。3.衰退阶段：自发性转化（SpontaneousTransformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）:即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系(Infinitecellline)或连续细胞系(Continuouscellline)，如：HeLa(人宫颈癌细胞系),SV-3T3(SV40转化小鼠3T3细胞,BHK(仓鼠肾成纤维细胞),F9(小鼠胚胎癌细胞),M2R(黑色素瘤细胞)等。

组织培养细胞的传代培养

当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。所谓细胞“一代”即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。

细胞传代的三个阶段

1）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。2倍体细胞该期时间长（24-96h），连续细胞系时间短（10-30min）。

2)指数生长期（Logarthmicgrowthphase）：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（MitoticindexMI）表示：即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contactinhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。但癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Densityinhibition）。

3)停滞期（Stagnatephase）：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少,代谢产物积累,PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。

二、细胞培养的基本条件

1)仪器和设备:常规的细胞培养设备如CO2孵箱,显微镜，培养器材如培养瓶,纯水设备,干燥消毒除菌设备,清洗设备等。

2)培养液:目前常用的基础培养液均有商品化,如RPMI1640,MEM,DMEM,F12等,可根据培养需求合理选择.细胞培养的基本条件

3)血清:一般常用为新生牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它动物血清.由于不同的研究目的,血清成分往往干扰研究实验,如进行某些药物和受体及特殊营养等方面的研究时,需要使用无血清培养基.4)其它添加成分:如缓冲系统,常用为HEPES(N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid),缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55,37℃为7.31.HEPES不是起维持pH恒定的作用,而是起恒定和抵抗快速pH变化的,所以调整pH常常用NaHCO3溶液;有机补充物如丙酮酸钠,谷胺酰氨等;促细胞分裂因子如生长因子类如FGF(成纤维细胞生长因子),EGF(表皮生长因子);贴壁和铺展因子如胶原蛋白,纤粘蛋白等.可根据培养细胞的特殊要求进行添加.细胞培养的基本条件

5)平衡盐溶液;主要用于作为稀释和灌注的液体,维持细胞渗透压,提供缓冲系统,使培养液的酸硷度维持在培养细胞生理范围内,提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等.常用有:PBS,Hank’s等,其配方可参考有关书籍.6)抗生素:常用为青霉素(每毫升培养液50-100单位)和链霉素(每毫升培养液50-100微克)，两性霉素（每毫升培养液20-25微克）。培养液的物理性质

PH:大多数细胞在PH7.4时生长最好,一般不低于6.8,不高于7.6.酚红是常用的指示剂,用来检测PH的变化.红色PH7.4;橙色PH7.0;黄色PH6.5;红蓝色PH7.6,紫色PH7.8.温度:温度除直接影响细胞生长外,与培养液的PH值有关,温度低时CO2溶解性增加,从而影响PH.渗透压:粘度:表面张力三、细胞培养的基本方法

一.组织、细胞的解离方法1.解离组织:在无菌情况下采取动物的组织或器官,放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中,然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理.

解离时应注意:1)尽可能将脂肪和坏死组织去除干净;2)剪碎组织时,避免损伤组织块;3)解离组织用的各种酶系,需要先进行低速离心.解离细胞

当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物;从单个细胞出发获得细胞群体;从一定量的组织中获得最多的细胞量时,常用酶和鳌合剂进行解离.解离细胞的方法1）胰蛋白酶解离细胞法(见图)2）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的.胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织.胶原酶最终浓度200u/ml,36.5℃温育,一般温育4-48h.3）机械解离细胞法（见图）细胞记数记数公式:

细胞浓度(细胞个数/每毫升)=(4个大方格细胞总数/4)×104×细胞原液稀释倍数原代细胞培养

1）外植块培养:外植块在一定限度内可保持其原有组织结构,有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。2）单层细胞培养:每隔1-3d换液一次,细胞长成单层后进行传代培养。3）悬浮细胞培养:使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长,或者由于细胞本身是不粘附的,如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞,或者是通过机械搅动使细胞保持悬浮状态,也可以通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。细胞培养中应注意的几个问题

1）培养液和培养物:一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长,不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。

2）PH:初培养pH应为7.4,培养过程应不低于7.0。培养瓶内的空间:一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。

3）容积、深度、表面面积:培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm。

4）去除死细胞:5）温度控制:动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃,细胞生长缓慢;温度高于37℃,细胞失去存活力。因此应按要求严格控制温度。细胞系及其鉴定

原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂,因此在培养初期,存活和生长的细胞类型也是多种多样的.所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长,而且是培养物逐步演进为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞,即细胞系(Cellline).细胞克隆技术

一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为克隆化(cloning)。细胞克隆技术的方法1.稀释铺板法(见图)2.饲养层克隆法(见图)3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法4.琼脂克隆法(见图)5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法.(见图)

细胞系鉴定指标

当细胞系建立后,应对细胞系进行一系列鉴定后,才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)细胞系的细胞来源2)鉴定细胞系的纯度,即除了主类细胞外,还杂有哪类细胞。3)细胞系的稳定性,即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据,以及其与来源细胞的差异等。细胞系鉴定指标1.形态学2.染色体:包括染色体数目和核型分析以及染色体分带技术.3.同工酶谱:通常以G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种.方法根据条件选择.4.细胞DNA遗传特征:限制性片断长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP)，是指那些在生物进化过程中,DNA序列发生某些中性突变,突变的结果是失去或获得一个酶切点,因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后,限制性内切酶片断加长或缩短;用同源的克隆DNA为探针就可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排,使DNA碱基排列序列改变,影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。一般采用Southern印迹杂交法检测。培养细胞的染色体

各种生物体细胞染色体各有其一定的数目、形态和结构,其可作为特化细胞的基本标志。染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标;也是检查细胞系是否趋于稳定,在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标;是区别正常细胞与恶性细胞的指标。培养细胞染色体测定项目1）染色体数目2）核型分析3）分带技术：G-,C-带分析具体操作步骤

1）培养细胞：取处于对数生长期，用较大瓶皿培养的80-90%汇合单层培养细胞。2）加秋水仙素：使用最终浓度为0.02-0.8mg/ml营养液，温箱继续培养6-10小时。3）采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢固的特点，手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲涮，这样约可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。具体操作步骤 4）离心：收集培养液，1000转/分离心5-10分钟。5）低渗处理：吸取上清液，加入预温至37ºC的0.075MKCL溶液，在温箱中静置20-30分钟。6）预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸甲醇固定液1ml，用吸管吹打均匀；此操作起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

具体操作步骤7）固定：离心，同4），吸除上清液，加新鲜固定液5-10ml，要用一手微斜持离心管，另一手用吸管吸取固定剂，将固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之缓慢流入离心管中，轻轻吹打均匀，放置15-20分钟。8）重复7），末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5-1ml。具体操作步骤9）制作：用滴片法制片，按如下步骤：将洁净的载玻片放4°C冰箱预冷，滴片前从冰箱取出冷载物片一张，在载玻片表面出现微细水气时，立即向片心一侧滴2-3滴细胞悬液（如固定液不散开，可能因载玻片未洗净或不冷所致）。滴片时的距离保持半米高度较好。滴片在室温中自然干燥，然后镜下观察并记数染色体数。具体操作步骤10）染色和封片：一般常用Giemsa染色，取Giemsa1份+9份PH6.8磷酸缓冲液混均匀，染色10分钟后，水洗，晾干，直接观察（适用油镜），如标本需要保存或做长期观察，可过二次二甲苯，用中性树胶封片。该过程难在制出的标本不是非常理想和一致，常出现分裂指数少，染色体分散不良，或染色体过短等，为此在初做时，应做预实验，摸清条件，提高成功率。培养细胞的污染与检测

细胞培养的污染问题十分重要，否则将会前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念，遇到培养污染要分析原因,及时处理，这一点十分必要。细胞污染的种类和判定

细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌和支原体。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染:1)培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。污染物的检测

1.细菌和真菌污染:细菌可采用涂片染色镜检的方法;真菌按以下培基用于检测(见表)2.支原体检测:

支原体污染细胞后,能抑制细胞代谢和生长,改变核酸合成,影响细胞的抗原性,引起细胞染色体改变,干扰病毒的复制,以及具有类病毒作用。支原体引起的一些细胞变化,可以继续传代下去,但在培养细胞时由于起初对细胞的繁殖影响较小而往往不引起重视，因此支原体应作为常规检测。支原体检测方法和处理

1）荧光技术检测:支原体含有DNA,能与一种荧光染料Hoechest33258特异性的结合,可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体.2）直接培养法:实验室常用.3)放射自显影检测:4)DNA分子杂交:3)污染支原体的处理:抗生素处理;共培养法;重新克隆法;过滤法.病毒检测

1）CPE或集落的检测;2）血细胞吸附试验;3）鸡胚接种.

细胞保存1）细胞冻存:梯度降温2）细胞复苏：37-39细胞的冻存与复苏1.冻存:注意：1）消化细胞不要过度

2）冻存液7：2：1或4：5：1DMSO为无色纯品，变黄勿用。3）温度：要逐步降温从4℃30m--20℃30m---70℃

1-2h,然后移入液氮罐内。4）细胞：对数生长期旺盛的细胞

5）做好记录：名称、日期、数量（还有代数)2.复苏：

37－39℃

温水，迅速摇动溶解。细胞能否顺利复苏，影响因素较多，如冻存时细胞的状态以及有无污染等。目前，有学者介绍还应注意一点，即细胞溶解后，可缓慢加入10倍冻存液的应用液培养12－48h，再换液。目的是逐渐稀释细胞和保护剂，避免细胞膜内外渗透压变化过于迅速而使部分细胞死亡细胞培养的应用组织培养细胞成为测试药物效应的常用对象。应用于杂交瘤技术中。应用于基因转导（Genetransfer)组织工程中适用于研究抗癌药物和致畸、致癌、致突变的药物。范围：1）鉴定有潜在活性的化合药物2）药物发挥毒性的作用机制3）预测可能用于临床的有效的细胞毒性药物

4）多种化合物中筛选有效成分及活性范围5）确定效应细胞类型6）确定毒性范围7）研