DNA重组的基本技术

高中生物选修3

现代生物科技专题专题1基因工程基础理论和技术的发展催生了基因工程

DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明基础理论技术发明1.什么叫基因？思考讨论？3.遗传信息是如何表达的？

2.基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？（1）原核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点※1.基因的结构能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质①非编码区：②编码区非编码区非编码区编码区编码区下游编码区上游RNA聚合酶结合位点调控遗传信息的表达原核细胞基因的结构

③RNA聚合酶结合位点：RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点启动子终止子编码区上游编码区上游④启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。⑤终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。编码区非编码区非编码区与RNA聚酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区上游（2）真核细胞的基因结构能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA。●内含子:●外显子:编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点信使RNA成熟的信使RNA真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列不能编码蛋白质的序列：包括非编码区和内含子原核核细细胞胞与与真真核核细细胞胞的的基基因因结结构构比比较较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的。没有内含子和外显子编码区是间隔的、不连续的。有内含子和外显子相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的。非编码区都有启动子、终止子和RNA聚合酶结合位点。思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？※2基因因表表达达的的调调控控原核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控乳糖糖代代谢谢基基因因表表达达调调控控图图解解：：(存存在在葡葡萄萄糖糖时时)ＲＰＯlacZlacYlacA调节节基基因因启动动子子操纵纵基基因因结构构基基因因RNA聚聚合合酶酶信使使RNA转录录翻译译阻抑抑物物与与操纵纵基基因因结合合，，结结构基基因因转转录受受阻阻．．阻抑抑物物原核核生生物物基基因因表表达达的的调调控控乳糖糖代代谢谢基基因因表表达达调调控控图图解解：：(只只存存在在乳乳糖糖时时)ＲＰＯlacZlacYlacA调节节基基因因启动动子子操纵纵基基因因结构构基基因因RNA聚聚合合酶酶信使使RNA转录录翻译译阻抑抑物物与与乳乳糖糖结结合合后后构构象象发发生生了了改改变变，，因因而而不不能能与与操操纵纵基基因因结结合合，，使使得得结结构构基基因因进进行行转转录录。。阻抑抑物物乳糖糖转录录半乳乳糖糖苷苷酶酶酶酶基因因工工程程产产品品抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼转黄黄瓜瓜抗抗青青枯枯病病基基因因的的甜甜椒椒乳汁汁中中含含有有人人生生长长激激素素的的转转基基因因牛牛(阿阿根根廷廷)资料位于费城托托马斯·杰杰斐逊大学学的希拉里里和她的同同事成功地地将人体狂狂犬病抗体体的DNA译码移入入烟草作物物中。转转基因因烟草作物物可以产生生一种人体体蛋白质，，而这种物物质能抗击击致命性的的狂犬病病病毒。基因工程的的定义：理论基础：：基本原理：：1.不同生生物的基因因结构上具具有一定的的相似性：：（1）基因因的基本单单位相同（2）具有有相同的碱碱基互补配配对原则（3）都是是双螺旋结结构2.不同生生物共用一一套密码子子。基因重组基因工程是是指按照人人们的愿望望，进行严严格的设计计，通过体体外DNA重组和转转基因等技技术，赋予予生物以新新的遗传特特性，创造造出更符合合人们需要要的新的生生物类型和和生物产品品。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技技术或DNA重组技技术生物体外基因因DNA分子水水平剪切→重组→→导入→表达达人类需要的基基因产物基因工程培育育抗虫棉的简要过程：：普通棉花(无无抗虫特性)苏云金芽孢杆杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因因)抗虫棉(有毒蛋白)上述培育抗虫虫棉的关键步步骤是什么？？重组DNA导入形成基因工程培育育抗虫棉的关关键步骤：关键步骤一：：抗虫基因从苏苏云金芽孢杆杆菌细胞内提提取出来关键步骤二：：形成重组DNA关键步骤三：：重组DNA导导入受体(棉棉花)细胞基因工程培育育抗虫棉的关关键步骤需要要哪些工具？？1.1DNA重组技术的的基本工具关键步骤一的的工具：关键步骤二的的工具：关键步骤三的的工具：分子手术刀——限制性内切切酶分子缝合针——DNA连接接酶分子运输车——运载体一、“分子手手术刀”———限制性核核酸内切酶（（限制酶）1.来源：主主要来自于原原核生物，如如：大肠杆菌菌细胞内可分分离出EcoRI限制酶※限制酶在原原核生物中的的作用原核生物容易易受到自然界界外源DNA的入侵，但但是，生物在在长期的进化化过程中形成成了一套完善善的防御机制制，以防止外外来病原物的的侵害。限制制酶就是细菌菌的一种防御御性工具，当当外源DNA侵入时，会会利用限制酶酶将外源DNA切割掉，，以保证自身身的安全。所所以，限制酶酶在原核生物物中主要起到到切割外源DNA、使之失失效，从而达达到保护自身身的目的。含有某种限制制酶的细胞，，其DNA分分子中或者不不具备这种限限制酶的识别别切割序列，，或者通过甲甲基化酶将甲甲基转移到所所识别序列的的碱基上，使使限制酶不能能将其切开。。在细菌体内与与相伴存在的的修饰酶（甲甲基化酶）共共同构成细菌菌的限制－修修饰体系，起起限制外来DNA、保护护自身DNA的作用一、“分子手手术刀”———限制性核核酸内切酶（（限制酶）1.来源：主主要来自于原原核生物，如如：大肠杆菌菌细胞内可分分离出EcoRI限制酶2.作用：识识别特定的核核苷酸序列并并水解特定的的两个核苷酸酸之间的磷酸酸二酯键。大大多数限制酶酶能够识别的的序列均为6个核苷酸（（个别4、5、8）(1)限制酶酶识别序列的的特点限制酶所识别别的序列，无无论是6个碱碱基还是4个个碱基，都可可以找到一条条中心轴线，，以中轴线双双侧的DNA上碱基呈反反向对称，重重复排列。如：：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC(2)切切点点：：AATTGCCTTAAG※与与DNA酶酶有有什什么么区区别别？？磷酸酸二二酯酯键键●实质质：：DNA酶酶：：不不特特异异性性识识别别序序列列水水解解DNA●水解解产产物物：：DNA酶酶：：限制制酶酶：：DNA片片段段基本本单单位位————脱脱氧氧核核苷苷酸酸能识识别别和和切切割割双双链链DNA分分子子特特异异序序列列的的核核酸酸水水解解酶酶限制制酶酶：：重播播3.作作用用结结果果：：切切割割DNA分分子子产产生生两两种种类类型型的的末末端端：：黏黏性性末末端端和和平平末末端端(1)黏黏性性末末端端被限限制制酶酶切切开开的的DNA两两条条单链链的的切切口口，带带有有几几个个伸出出的的核核苷苷酸酸，他他们们之之间间正正好好互补补配配对对，这这样样的的切切口口叫叫黏性性末末端端。DNA被被限限制制酶酶切切断断后后有有两两个个反反向向互互补补的的““黏黏性性末末端端””。。被被同同一一种种限限制制切切断断的的几几个个DNA具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端，，能能够够通通过过互互补补进进行行配配对对。。(2)平平末末端端在识识别别顺顺序序的的对对称称轴轴上上，，对对双双链链DNA同同时时切切割割。。4.举举例例：：EcoRI限限制制酶酶能能识识别别GAATTC序序列列，，并并在在G和和A之之间间切切开开限制制酶酶要想想获获得得某某个个特特定定性性状状的的基基因因必必须须要要用用限限制制酶酶切切几几个个切切口口？？可可产产生生几几个个黏黏性性末末端端？？要切切两两个个切切口口，，产产生生四四个个黏黏性性末末端端。。如果果把把两两种种来来源源不不同同的的DNA用用同同一一种种限限制制酶酶来来切切割割，，会会怎怎样样呢呢？？会产产生生相同同的的黏黏性性末末端端，然然后后让让两两者者的的黏黏性性末末端端黏合合起来来，，就就可可以以重组组的的DNA分分子子了。。思考考※限限制制酶酶的的命命名名●第一一个个字字母母（（大大写写、、斜斜体体））该该酶酶的的微微生生物物属属名名●第二二、、三三个个字字母母（（小小写写、、斜斜体体））代代表表微微生生物物种种名名●第四个字字母（斜斜体）代代表表寄主菌菌的株或或型●用罗马数数码I、、II、、III等区分分同一株株具有有不同特特异性的的酶例流感感嗜血杆杆菌中三三个酶的的命名：：

Haemophilusinfluenzaed属属名名种种名株株系HindIIIIIIHindIHindIIHindIII※限制酶酶的分类根根据限制制酶的识识别切割割特性、、催化条条件及是是否具有有修饰酶酶活性可可分为：：I型II型型III型型1.I型型限制酶酶

属于于复合功功能酶，，兼有修修饰和切切割DNA两种种特性。。功能核酸内切切酶甲甲基化酶酶

ATP酶DNA解旋酶酶2.III型酶酶

与I型酶特特性类似似，也有有甲基化化功能，，但无ATP酶酶和DNA解旋旋酶活力力。在在DNA链上有有特异位位点切割割，其切切割位点点在识别别位点以以外。3.II型酶（（1）II型酶的识识别识识别序序列一般为为4-6个个碱基对，，通常是反反转重复顺顺序，具有有180ºº的旋转对对称性。（（2）II型酶的的切割功能能★5’端黏性性末端（cohesiveend)在在识识别顺序的的双侧末端端切割DNA双链，，于对称轴轴的5’末末端切割。。※黏性末端★3’端黏性性末端在在识别顺序序的双侧末末端切割DNA双链链，于对称称轴的3’’末端切割割。※少数有特殊殊性质的酶酶<1>异源同工酶酶（isoschizomer）定定义义：来来源不不同但能识识别和切割割同一位点点的酶。

5’CCGG3’3’GGCC5’

5’CCGG3’3’GGCC5’HpaII、MspI<2>同尾酶（isocaudarner)为为识识别与切割割顺序相互互有关的酶酶。有有些些限制酶的的识别序列列包含在另另一些限制制酶的识别别顺序之中中酶酶来源源不同，但但它们作用用后能产生生相同的粘粘性末端。。5’GGATCC3’3’CCTAGG5’5’AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII5’GGATCC3’3’CCTAGG5’DNA连接酶酶G

AA

TT

CC

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GG

AA

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CC

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GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

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GGC

TT

AA

AA

TT

C

G同种限制酶切割二、“分子缝缝合针”———DNA连接接酶DNA连接酶酶可把黏性末末端之间的缝隙“缝合””起来，恢复被被限制酶切开开的两个核苷苷酸之间的磷磷酸二酯键，，形成重组的的DNA分子子。1.作用：将将互补配对的的两个黏性末末端连接起来来，使之成为为一个重组的的DNA分子子DNA连接酶酶与DNA聚聚合酶一样吗吗？为什么？？2.作用结果果：

在切口口处催化形成成磷酸二酯键键。切口：DNA分子糖-磷磷酸主键的破破坏。

缺口口：DNA分分子中核苷酸酸缺失。切口口：：DNA5’’磷磷酸酸基基与与3’’羟羟基基之之间间的的缝缝隙隙注意意：：DNA连连接接酶酶只只能能作作用用于于双双链链DNA分分子子而而不不能将将二二个个单单链链DNA分分子子连连接接。。（1））从从大大肠肠杆杆菌菌中中分分离离得得到到：：E.coliDNA连连接接酶酶，，只只能能将将双双链链DNA片片段段互互补补的的粘粘性性末末端端之之间间连连接接。。（2））从从T4噬菌菌体体中中分分离离到到：：T4DNA连连接接酶酶，，既既可可以以““缝缝合合””双双链链DNA片片段段互互补补的的粘粘性性末末端端，，又又可可以以““缝缝合合””双双链链DNA片片段段的的平平末末端端，，但但连连接接平平末末端端之之间间的的效效率率比比较较低低。。3.分分类类（（酶酶的的来来源源））T4噬菌菌体体DNA连连接接酶酶大大肠肠杆杆菌菌DNA连连接接酶酶※T4噬菌菌体DNA连接接酶连接接带粘性性末端DNA分分子的效效率远高高于连接接平末端端的DNA分子子※连接反应应需要ATP提提供能量量。外源基因因(如抗抗虫基因因)怎样样才能导导入受体体细胞(如棉花花细胞)？导入过程程需要运运输工具具——运运载体。。运载体的的作用有有哪些？？作用一：：作为运运载工具具，将外外源基因因(抗虫虫基因)转移到到受体细细胞(棉棉花细胞胞)中去去。作用二：：利用运运载体在在受体细细胞(棉棉花细胞胞)内，，对外源源基因(抗虫基基因)进进行大量量复制。。作为运载载体必须须具备哪哪些条件件？1）能够够在宿主主细胞中中复制并并稳定地地保存。。2）载体体DNA必须有有一个或或多个限限制酶切切点，以以便目的的基因插插入到载载体上去去。3）具有有某些标标记基因因，便于于进行筛筛选。如抗菌素素的抗性性基因、、产物具具有颜色色反应的的基因等等。载体DNA必须须是安全全的,不不会对受受体细胞胞有害;5)载载体DNA分分子大小小应适合合,以便便提取和和在体外外进行操操作,太太大就不不便操作作.三、基因因的载体体——““分子运运输车””2.载体体必须具具备的条条件：（1）能能够在宿宿主细胞胞中复制制并稳定定地保存存；（2）具具有多个个限制酶酶切点，，以便与与外源基基因连接接；（3）具具有某些些标记基基因，便便于进行行筛选。。（如抗抗菌素的的抗性基基因、产产物具有有颜色反反应的基基因等））（4）对对受体细细胞无害害（5）载载体DNA分子子大小应应适合1.载体体的作用用：（1）将将外源基基因转移移到受体体细胞中中去。（2）利利用运载载体在受受体细胞胞内，对对外源基基因进行行大量复复制。3.常用用的载体体有：质粒，λλ噬菌体体的衍生生物，动动植物病病毒等4.质粒粒——基因工程程最常用用的