第十章dna生物合成

第三篇遗传信息的传递第十九章细胞信号转导的分子机制主要内容

刘皓email:生物化学与分子生物学教研室第三篇遗传信息的传递

DNA复制、转录和翻译基因表达调控基因重组与基因工程（1958，F.Crick）Reversetranscription

第十四章

DNA的生物合成

DNABiosynthesis

(DNAReplication)复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA主要内容

复制的基本特征

DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的过程逆转录和其他复制方式

DNA损伤（突变）与修复复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)

复制的基本特征

一、半保留复制是DNA复制的基本特征

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律指导合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。由于碱基互补，两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:N15N15-yellowstrandN14-blackstrandN14G0G1G2heavyintermediatelightMeselson-Stahlexperiment

DNAcentrifugedinCesiumChloride,heavyDNAsettleslowerintubeRP5N15-DNAN14-DNAAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA复制的分子基础：碱基配对规律和DNA双螺旋结构按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。复制时，DNA从特定的起始点(origin，ori)开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制叉(replicationfork)：复制时DNA双链解开成双股，各自作为模板，子链延模板延长时所形成的一种Ｙ字形结构。

二、双向复制A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’三、半不连续复制3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)

。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(laggingstrand)

。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationDNA复制的反应体系:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。

参与DNA复制过程的酶或蛋白质因子：

a.DNA聚合酶(DNApolymerase)b.与DNA解旋和解链有关的酶：解螺旋酶(Helicase)

引物酶(Primase)

拓扑酶(DNAtopoisomerase)

单链DNA结合蛋白(Single-strandDNA-bindingprotein,SSB)c.DNA连接酶(DNAligase)一、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶

(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol1.复制的基本化学反应(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPiDNA聚合酶的作用特点以四种脱氧三磷酸核苷(dNTP)作底物；需要接受模板的指导;DNA新链生成需引物3’-OH的存在；新链的延长只可沿5→3方向进行。（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性:53外切酶活性:?切除引物和突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:

DNA-polⅠ

功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。核心酶：α，θ和ε亚基原核生物的DNA聚合酶共性：都具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性（二）真核细胞DNA聚合酶：五种DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-polDNA-polDNA-pol真核生物的DNA聚合酶(三)DNA聚合酶与复制的保真性

(fidelity)复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。a.核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。

A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNApolⅠ的校读功能b.复制的保真性依赖正确的碱基选择错配碱基之间难以形成氢键DNA聚合酶对核苷酸的参入有选择功能遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的即时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：二、与DNA解旋与解链有关的酶DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态E.Coli基因图1.解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。2.引物酶(primase)

——复制起始时催化游离NTP聚合生成RNA引物的酶。3.单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)

——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。SSB与DNA单链的结合表现出协同效应。108局部解链后4.DNA拓扑异构酶:改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成既能水解、又能连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：三、DNA连接酶催化互补双链DNA中单链切口处的相邻3-OH末端和5-P末端之间生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。

DNA连接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶的作用：

DNA连接酶并不能连接单独存在的单链DNA缺口，它所连接的都是在碱基互补的基础上的缺口。

DNA连接酶也可连接DNA两股链都有的缺口，但缺口的碱基必须互补。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较

提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列53531.DNA解链识别区富含AT区DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352.引发体(primosome)和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶

复制起始的顺序

DnaA辨认结合Ori识别区，几个Dna蛋白相互靠近，并使富含AT区开链

DnaC协同DnaB进入起始部位

DnaA

进一步解链,SSB与解开的单链结合

引物酶（DnaG）进入

形成引发体

以NTP为原料,从5′3′合成RNA引物

DNAPOLⅢ催化第一个dNTP加到RNA引物的3/-OH上（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polⅢ领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。随从链的合成解链方向同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接：复制过程简图二、真核生物的DNA合成端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒的功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：端粒酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四节逆转录酶(reversetranscriptase)

逆转录(reversetranscription)

逆转录酶一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录RNADNA逆转录酶的活性：依赖RNA的DNA聚合酶RNase依赖DNA的DNA聚合酶逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNARNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。前病毒基因组通过基因重组，整合到宿主细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

滚环复制(rollingcirclereplication)二、滚环复制是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。3-OH5-P55533335'滚环复制5'5335DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第五节DNA突变：指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNAdamage)。突变的分子基础：DNA分子上碱基的改变二、引发突变的因素自发突变：发生频率约10-9左右诱发突变：主要有物理和化学因素物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV化学因素：三、ＤＮＡ突变的类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。

（一）错配可导致编码氨基酸的改变镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

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leu

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pro·

val

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glu

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C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

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C肽链CTCGAG基因镰形红细胞贫血病人（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个