第二章 中药化学成分提取、分离和鉴定的一般方法

第2章中药化学成分提取、分离

和鉴定的一般方法目的要求了解中药化学成分的类型及理化性质。掌握中药有效成分的提取、分离方法。了解中药有效成分结构鉴定的方法。教学内容第1节中药中所含各类化学成分简介第2节中药化学成分预试验第3节提取、分离中药有效成分常用的方法第4节中药化学成分鉴定和结构研究简介第5节药理供试样品的配制第1节中药中所含各类化学成分简介生物碱糖和苷醌类苯丙素类黄酮类强心苷皂苷萜类和挥发油其他成分生物碱（alkaloids）生物体内的含氮有机物，有似碱的性质（能与酸成盐），有生理活性。盐酸小檗碱(Berberinehydrochloride)苷类（glycosides）

苷元与糖或糖的衍生物通过苷键（缩醛键）连接而成的化合物。苷易水解成苷元和糖。人参皂苷Rb1

(ginsenosideRb1)水解糖类（saccharides）单糖：无色晶体，味甜。易溶于水，难溶于有机溶剂。低聚糖：2~10个单糖缩合而成。味甜，溶于水，难溶于有机溶剂。多糖：10个以上单糖脱水缩合而成。无甜味，大多不溶于水。

D-葡萄糖L－鼠李糖D－葡萄糖醛酸(D-glucose)(L-rhamnose)(D-glucuronicacid)α-D-Gal-(1→4)-β-D-Glc-[β-D-Fru-(1→6)]-(1→4)-β-D-Glc醌类（quinones）具有醌式结构化合物。分子中多有酚－OH，有一定酸性。

大黄酚大黄酚-D-葡萄糖苷

(chrysophanol)(chrysophanol-8-D-glucoside)苯丙素类（phenylpropanoids）以苯丙基（C6-C3）为基本骨架的化合物。

香豆素：具有苯骈α-吡喃酮母核的一类天然化合物。

木脂素：有两分子苯丙素衍生物聚合而成的天然化合物。

七叶内酯五味子酯甲

(aesculetin)(schisantherinA)黄酮类（flavonoids）两个苯环通过三碳链连接而成（C6-C3-C6）的化合物。多有酚－OH，有一定酸性。

黄芩素黄芩苷

(baicalein)(baicalin)萜类和挥发油（terpeonidsandvolatileoils）萜类：由甲戊二羟酸衍生、分子式符合（C5H8）n的衍生物。

挥发油（精油）：可随水蒸气蒸馏的与水不相混溶的无色或淡黄色透明油状液体。

薄荷醇细辛醚

(menthol)(asarone)强心苷（cardicaglycosides）对心脏有显著生理活性的甾体苷类。无色，有旋光性、对粘膜有刺激性。

洋地黄毒苷

(digitoxin)皂苷（saponins）由螺甾烷类或三萜类化合物与糖结合的低聚糖苷，前者为甾体皂苷，后者为三萜皂苷。无色，对粘膜有刺激性，有吸湿性、发泡性和溶血性。

薯蓣皂苷人参皂苷Rb1

(dioscin)(ginsenosideRb1)其他成分有机酸鞣质氨基酸、蛋白质和酶植物色素树脂油脂和蜡无机成分微量元素第2节中药化学成分预试验目的：初步判定中药中含有哪些化学成分，为设计提取、分离方案奠定基础。1.预试验的分类2.预试验的方法3.预试验供试液的制备1.预试验的分类单项预试：重点检查某类成分。系统预试：全面检查各类成分。2.预试验的方法试管法纸片法薄层及纸色谱法3.预试液的制备水浸液

5g/50ml水，浸泡过夜，过滤。滤液A用以检查氨基酸、多肽、蛋白质；滤渣水浴60℃加热10min，过滤。滤液B用以检查糖、有机酸、苷、鞣质、水溶性生物碱等。乙醇提取液中性醇提液：5g/50ml95%乙醇，水浴加热回流20min，过滤。滤液用以检查黄酮、蒽醌、香豆素、萜、苷等。酸性醇提液：2g/10ml0.5%盐酸乙醇溶液，水浴加热回流10min，过滤。滤液用以检查生物碱等。石油醚提取液1g/10ml，浸泡2-3h，过滤。滤液用以检查挥发油、萜类等。常用显色剂：生物碱：碘化铋钾试剂棕红色酚：三氯化铁试剂蓝色有机酸：溴酚蓝试剂蓝色背景黄色斑点皂苷：磷钼酸试剂蓝-蓝紫色内酯、香豆素：异羟肟酸铁试剂蓝-紫黄酮：三氯化铝试剂、盐酸-镁粉、乙酸镁试剂+蒽醌：氢氧化钾试剂红色强心苷：3,5-二硝基苯甲酸试剂紫红色氨基酸：茚三酮试剂+挥发油：油斑试验无斑点有机化合物：硫酸试剂第3节提取分离中药有效成分常用的方法概述提取方法分离纯化方法影响因素1.概述（1）中药化学成分的构成特点同种植物含有多种结构类型的化学成分总成分含量少而种类多有效成分含量低（2）提取分离前进行文献调研研究进展

a.做过否？

b.研究的深度和广度如何？

c.如何开展？药材鉴定

a.原植物的拉丁学名

b.采集地点和时间

c.药及部位

d.民间药用情况（3）已知/未知成分研究策略已知成分：结构类型，确定提取、分离路线；未知成分：系统预试验，活性跟踪；

2.提取方法溶剂提取法水蒸气蒸馏法超临界流体萃取法其他方法（1）溶剂提取法

原理：相似相溶。溶剂穿透入药材粉末的细胞膜，溶解溶质，形成细胞内外溶质的浓度差，将溶质渗出，进行提取。

范围：所有化学成分。溶

剂沸点介电常数(20℃)溶解度溶剂/水%水/溶剂%石

油

醚环

己

烷30-12080.71.892.02苯乙

醚氯

仿乙酸乙酯正

丁

醇

803561771182.294.344.816.0217.8

0.1756.040.8156.077.45

0.0631.4650.0722.9820.5丙

酮乙

醇甲

醇水

567865100

20.724.332.680.4任意混合石油醚>环己烷>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水常用溶剂的性质中药各类成分的极性与提取溶剂的关系

植物成分极性强弱植物成分结构类型适于提取溶剂亲脂性强叶绿素、脂肪油、挥发油石油醚亲脂性较强游离生物碱、苷元、甾类、萜类、某些有机酸乙醚、氯仿中等极性中偏小某些苷类(如强心苷等)氯仿-乙醚(2:1)中等某些苷类(如黄酮苷类)乙酸乙酯中偏大某些苷类(如蒽醌苷、皂苷等)正丁醇亲水性较强极性大的苷、糖类、氨基酸等丙酮、乙醇、甲醇亲水性强蛋白质、粘液汁、糖类、氨基酸、无机盐、苷类水（1）溶剂提取法选择溶剂注意点：

a.对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小

b.不与化学成分起化学变化

c.经济、易得、使用安全。常用操作方法：

浸渍法渗漉法煎煮法回流提取法连续回流提取法影响提取效率的

因

素原料粉碎度提取时间提取温度设备条件回流提取装置冷凝管通气侧管药材虹吸管溶剂水浴索氏提取装置优劣对比：浸渍：简便，但效率低，用水时易发霉。渗漉：效率高，效果好（较澄清）；但溶剂消耗大，费时。煎煮：简便，但杂质溶出多，难过滤。回流提取：效率高，但溶剂消耗大，操作烦琐。连续回流提取：效率高,溶剂消耗少,但操作烦琐。

*后三种不适宜加热易分解成分的提取。（2）水蒸气蒸馏法原理：与水蒸气产生共沸点。范围：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。如挥发油、小分子量的生物碱等。（3）超临界流体提取法原理：用处于超临界条件下的特殊流体（介于气体和液体之间）为溶剂，具有更低的黏度和更高的扩散速度，对许多物质有很强的溶解能力。如CO2：Tc31.4℃，Pc7.37Mpa

范围：适用于对热及化学不稳定的成分、低极性的成分的提取。特点：接近室温工作，适用对热不稳定的成分，无有机溶剂残留，对环境无公害，提取效率高，节约能耗等。但对设备要求高。（4）其他方法升华法樟脑（樟木）咖啡因（茶叶）压榨法固相提取法超声提取法微波提取法酶提取法3.分离纯化方法利用溶解度差异进行分离利用分配系数差异进行分离利用吸附性能差异进行分离利用分子大小不同进行分离其他方法（1）溶解度差异原理：相似相溶。方法：重结晶法、沉淀法等。溶解度差异原理：被分离组成在两种互不相溶的溶剂中的分配系数（K）的不同达到分离。

K与萃取次数的关系：分离因子（b值）与分离难易的关系：方法：简单萃取法、连续萃取法、液滴逆流法（DCCC）、高速逆流法（HSCCC）、气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）等。b=KA/KBK值与萃取次数成反比。即K值越大，萃取次数越少，反之越多。b值越大，越易分离；b＝1时，无法分离（2）分配系数差异

简单萃取法

用于比水轻的溶剂用于比水重的溶剂连续萃取器液滴逆流分配装置图能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。由于流动相形成液滴，在较细的萃取管中与固定相有效接触、不断摩擦形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，且不会产生乳化现象。（3）吸附性能差异物理吸附（表面吸附）规律：“相似者易于吸附”特点：无选择性、可逆吸附、快速原理：吸附与解吸附的往复循环三要素：吸附剂（硅胶、氧化铝、活性炭）、溶质(被分离物)、溶剂极性强弱的判断：

(1)亲水性基团与极性成正比，亲脂性基团成反比；

(2)游离型化合物亲脂、极性弱，解离型亲水、极性强。溶剂的极性：依据介电常数来决定极性吸附剂：吸附剂一定时，溶质极性越强，洗脱剂极性也应越强。非极性吸附剂：吸附剂一定时，溶质极性越强，洗脱剂极性应越弱。（3）吸附性能差异化学吸附：特点：有选择性、不可逆吸附原理：产生化学反应酸性物质与氧化铝发生化学反应碱性物质与硅胶发生化学反应氧化铝容易发生结构的异构化半化学吸附：特点：吸附力介于上述二者之间原理：氢键吸附，如聚酰胺、大孔树脂等

（4）分子大小差异原理透析法（半透膜膜孔的分子筛作用）凝胶滤过法(三维网状结构的分子筛作用)

超滤法(分子大小不同引起的扩散速度的差别)

超速离心法(溶质在超速离心作用下沉降性的差别）三要素载体(葡聚糖凝胶)、溶质(被分离物)、洗脱剂应用蛋白质的脱盐精制；蛋白、多糖的分离；大分子化合物如糖苷类成分的精制（5）离解度不同（离子交换树脂）原理利用酸、碱化合物在解离状态时与阴、阳离子树脂产生离子交换的原理达到分离的方法。三要素固定相(离子交换树脂)、溶质(被分离物)、洗脱剂应用酸、碱类化合物如氨基酸、生物碱、有机酸的分离常用色谱分离方法介绍：

吸附剂分离原理吸附规律应用硅胶吸附原理弱酸性、极性吸附剂广泛（酸、碱及化合物极性越大、中性成分均可）吸附能力强（难洗脱）溶剂极性越小，吸附力越强

氧化铝吸附原理碱性、极性吸附剂碱性、中性成分吸附规律同上（酸性成分与铝络合）活性炭吸附原理非极性吸附剂从稀水溶液中富集微量物质吸附规律与上相反脱色（脂溶性色素）聚酰胺氢键吸附形成氢键越多，吸附力越强黄酮、蒽醌的分离大孔吸附树脂吸附原理非极性化合物易被非极性树脂吸附糖与苷的分离

吸附色谱类型固定相流动相应用正相色谱水>BAW系统极性、中极性物质分离（以PPC为例）反相色谱ODS<甲醇-水、乙腈-水最广泛，非极性、中极性各类物质的分离

加压液相色谱类型压力（Pa）分离规模分析用高压液相色谱（HPLC）>20.2×1051mg左右制备用高压液相色谱（HPLC）>5mg中压液相色谱(MPLC)5.05~20.2×105>100mg低压液相色谱(LPLC)<5.05×10510mg~1g快速色谱约2.02×105>10mg液-液分配色谱（分配原理）葡聚糖凝胶色谱

类型原理溶胀溶剂应用

葡聚糖凝胶分子筛（大→小）水多糖、多肽、（SephadexG）蛋白质分离羟丙基葡聚糖凝胶分子筛（糖苷）水、极性有机溶剂不同类型（SephadexLH-20）吸附原理（苷元）或二者的混合溶剂化合物分离离子交换吸附树脂树脂类型原理应用阳离子交换树脂离子交换从酸水溶液中吸附碱性成分（生物碱）强酸性（R-SO3-H+）（阳离子）（除去酸性、中性成分）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂离子交换从碱水溶液中吸附酸性成分（有机酸）强碱性（RN+(CH3)3CI-）（阴离子）（除去碱性、中性成分）弱碱性(伯、仲、叔胺)（6）其他纯化方法盐析法中药水提液，加无机盐达到一定浓度（饱和），有些成分则分离。常用盐：NaCl,Na2SO4,MgSO4,(NH4)2SO4等。例，三颗针提取小檗碱加NaCl。分馏法利用不同成分的沸点不同而分离。常用于挥发油、生物碱等。例，毒芹总碱中毒芹碱166-167℃，羟基毒芹碱226℃。4.影响因素光照酸碱温度溶剂层析过程光照酸碱溶剂层析过程第4节中药化学成分鉴定和结构研究简介化合物的纯度测定结构研究的主要程序结构研究的主要方法结构研究实例1.化合物的纯度测定晶形

结晶均匀、一致熔点

熔点明确、敏锐，熔距0.5-1.0℃薄层色谱或纸色谱

三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点HPLC、GC等色谱方法

呈现单一色谱峰2.结构研究的主要程序初步推断化合物类型测定分子式，计算不饱和度确定官能团、结构片断、骨架推断平面结构确定主体结构1.观察样品在提取、分离过程中的行为2.测定理化常数，如溶解度、色谱行为、定性反应等3.结合文献调研1.高分辨质谱（HR-MS）2.元素分析（EA）3.同位丰度比法1.测定解析波谱数据（UV,IR,NMR,MS）2.官能团定性定量分析1.综合分析谱学数据及定性、定量分析结果2.与已知化合物进行比较1.测定CD或ORD2.测定NOE或2D－NMR3.X－射线衍射分析4.人工合成3.结构研究的主要方法（1）确定分子式、分子量，计算不饱和度分子式的确定元素分析法→实验式（结合分子量）→分子式同位素丰度比法（﹤500）↑

HR-MS→分子量、分子式

不饱和度的计算

U=1+n4-0.5(n1-n3)MS冰点下降法沸点上升法粘度法凝胶滤过法3.结构研究的主要方法（2）化学法确定化合物结构骨架与官能团颜色反应化学反应3.结构研究的主要方法（3）波谱法研究化合物结构

UV

IR

NMR

MS

ORD

CD

X-射线单晶衍射紫外－可见吸收光谱（UV-vis）定义分子中的电子可因光线照射从基态跃迁至激发态，其中π-π*、n-π*跃迁由吸收紫外光或可见光引起，此区域测得的光谱为紫外－可见光谱。测定样品量很少。应用已知化合物：化合物的初步鉴定及含量测定。未知化合物：推断骨架，如含共轭双键、α,β-不饱和羰基、芳香化合物等。电子跃迁与UV-vis光谱β－藏茴香酮的UV光谱定义分子中价键的伸缩及弯曲振动在光的红外区域（4000-500cm-1）引起吸收，测得的图谱为红外光谱。反映功能团与波长的关系。只需5-10μg。4000-1500cm-1为特征区，1500-500cm-1为指纹区。应用已知化合物：测定红外光谱叠图或检索红外光谱数据。未知化合物：用于确定官能团以及芳环取代的判断等。红外光谱（IR）s-(-)-藏茴香酮的IR光谱定义化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的1H原子核吸收一定能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得。氢同位素中，1H丰度最大，信号灵敏，1H-NMR易测，应用广。应用测定化学位移（δ0-20ppm）、谱线的积分面积及裂分情况（重峰数及偶合常数），提供分子中1H的类型、数目及相邻原子或原子团的信息。核磁共振氢谱（1H-NMR）

化学位移（Chemicalshift,δ）

1H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度以及绕核旋转时产生的磁的屏蔽效应也不同。不同类型的1H共振信号出现在不同的区域，可识别。峰面积由于1H谱上积分面积与分子中的总质子数相当，故如知分子式，可据此算出每个信号所相当的1H数。信号的裂分及偶合常数磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生分裂，表现出不同的裂分，如singlet、doublet、triplet、quartet、multiple等。不同类型氢核化学位移的大致范围NOE效应当两个质子HA和HB在空间非常接近时，对HA做饱和照射时，HB的信号强度会增加，这种现象称为NOE效应。当照射3.84ppm（OCH3）信号时，6.88ppm处5-H的信号增强，判断－OCH3应处于6-C上。2D－NMR

1H-1HCOSY：相邻质子间的偶合关系。

13C-1HCOSY：HMQC，1H和与其直接相连的13C的偶合关系。HMBC，1H和与其远程偶合的13C的关系。

乙酸乙酯的1H-1HCOSY图谱定义化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的13C原子核吸收一定能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得。应用提供的结构信息是分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移（δ0-200ppm），异核偶合常数及弛豫时间，其中利用度最高的是化学位移。核磁共振碳谱（13C-NMR）噪音去偶谱（全氢去偶谱COM或宽带去偶谱BBD）

采用宽频的电磁辐射照射所有1H使之饱和后测定13C-NMR谱。1H对13C的偶合全部消除，所有13C信号在图谱上均作为单峰出现，无法确定连接的1H数，但对判断13C信号的化学位移很方便。选择氢核去偶谱（SPD）或远程选择氢核去偶谱（LSPD）对某个或某几个氢核进行照射，以消除其偶合影响。此时峰形发生改变的信号只是与之有偶合关连的13C信号。

DEPT通过改变照射1H核的脉冲宽度（θ）或设定不同的驰豫时间，使不同类型的1H信号在谱图上呈单峰并分别呈现正向峰或倒置峰，灵敏度高，信号间重叠少，一种常规测定方法。β-紫罗兰酮的质子非去偶谱β-紫罗兰酮的噪音去偶谱β-紫罗兰酮9位羰基的LSPD谱a.质子非去偶谱b.照射7-H,8-Hc.照射7-H,10-Hd.质子噪音去偶谱e.照射10-Hf.照射8-H,10-Hβ-紫罗兰酮的DEPT谱定义

MS是记录分析样品在质谱仪中经高温气化（300℃），在离子源受一定能量冲击产生阳离子，同时发生某些化学键的有规律的断裂，而后在稳定磁场中按质量和电荷之比（m/z）顺序进行分享并通过检测器表达的图谱。

应用（测定分子式和分子量）已知化合物：通过比较质谱图进行鉴定。未知化合物：由碎片峰及裂解特征推定或复核分子的部分结构。质谱（MS）EI-MS（电子轰击电离,electronimpactionization）测定时需先加热气化再电离，故易热分解或难气化的化合物，测不到分子离子峰。

FD-MS（场解析电离,fielddesorptionionization）将试样稀溶液涂在钨丝发射极上，通过真空密封系统进入离化室作为阳极，再安装阴极，加10kV的高电压使其电离。适用于热不稳定、极性大、难挥发的化合物。高质量区的信息较为详尽。

FAB-MS（快原子轰击电离,fastatombombardment）从离子枪射出的一次离子经加速后在碰撞室通过交换电荷，产生高速中性离子，该中性离子撞击试样即可使之电离，得到分子离子及进一步裂解的碎片。碎片类型与FD-MS相同，但低质量区的结构信息也较为详尽。桂皮酸乙酯EI-MS图Balanitin-1的FD-MS图ORD（旋光谱，OpticalRotatoryDispersion）

定义用不同波长的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对比旋光度或摩尔旋光度作图所得的曲线。应用推断不对称分子的构型和构象。CD（圆二色谱，CircularDichroism）定义记录化合物在紫外光与可见光区所产生的椭圆偏振光的椭圆度与波长的关系。CD谱是透过介质后的光的吸收曲线，而ORD则是它的分散曲线。应用测定手性化合物的构型、构象、确定某些官能团在手性分子中的位置等。X－射线单晶衍射定义通过测定化合物晶体对X射线的衍射谱，再通过计算机用数学方法解析衍射谱，再还原为分子中各原子的排列关系，最后获得每个原子在某一坐标系中的分布，给出化合物化学结构，获得分子的全貌，是一种很好的测定化合物分子结构的方法。同时还能测定出化合物结构中的键长、键角、构象、绝对构型等结构细节。应用测定大分子物质结构。4.结构研究举例今由某药材中分离得到一种成分A，测得下列数据：无色针晶，mp154-156℃，[a]–59°(EtOH)

易溶于MeOH,EtOH,H2O，难溶于CHCl3,Et2O

Molish反应（＋），FeCl3反应（－）IR(cm-1):3250~3500,1610,1590,1575,1075,1045,1020,1010,860,830MS(m/z):286(M+),163,145,127,124(100%)；其乙酰物m/z496（M+）

苦杏仁酶水解后得一个溶于乙醚的针晶B及D-葡萄糖酶水解后所得针晶B，测得下列数据：mp112~115℃元素分析C67.4%H6.50%

Gibb’s反应（－），FeCl3

反应（+）MS(m/z):124(M+)

1H-NMR(d):3.97(1H,t,D2O交换消失)4.51(2H,d)6.78,7.18(4H,AA’,BB’系统)8.20(1H,s,D2O交换消失)第5节

中药药理供试样品的配制常用制剂中药制剂浓度表示法

1.常用制剂（1）水溶液

易溶于水的成分用蒸馏水或生理盐水配制,用稀酸或稀碱溶液时pH4-9为宜。可加热或加增溶剂。（2）低浓度有机溶剂

适用于易溶于有机溶剂，而难溶于水的提取物。常用乙醇、丙二醇等，含量<10%。可加入增溶剂，有机溶剂:增溶剂:水=1:1:8。

（3）油剂适用于不溶于水而易溶于油的成分，用精制植物油配制。（4）乳剂适用于脂溶性物质。用精制植物油配制，常用吐温-80、PEG-400等。油:乳化剂:水=1:1:8。

（5）混悬剂适用于油、水中均不溶的提取物。常用助悬剂5%淀粉、0.5%CMC-Na、1%西黄芪胶等。（6）冻干剂适用于对热不稳定的成分如蛋白质、鞣质等。提取物经冷冻干燥，临用前用水配制。（7）固体制剂难于制成上述剂型的中药提取物，直接粉碎。

2.中药制剂浓度表示法（1）生药量单味中药：如生附子水煎液0.125g/ml

中药复方：如麻黄汤水煎液3g/ml

（2）有效部位含量

（3）摩尔浓度（mol/L，M）小结：1.植物中存在的各类化学