第七章化学酶工程

第七章

化学酶工程前言一．酶的化学修饰原因1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．酶的主要动力学性质的不适应—易受产物和抑制剂抑制。3．体外的反应条件不在其最适反应条件范围内。4．临床应用的特殊要求不符合—体内使用时候，异体蛋白抗原性、蛋白水解酶、半衰期短、不能在靶部位有效聚集。教学重点：酶分子化学修饰的原理；酶分子化学修饰的方法7.1.酶化学修饰

定义：在较温和条件下，以可控方式使酶同某些化学试剂发生特异反应，引起酶分子中某些基团发生共价的化学改变的过程（狭义）。凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为酶蛋白的化学修饰（广义）。酶修饰的方向1．蛋白质水平（化学修饰）2．核酸水平1．酶经化学修饰后，能减少由于内部平衡力被破坏而引起的酶分子伸展，增强酶天然构象的稳定性；2．酶表面形成缓冲外壳，抵御外界环境，维护酶活性部位稳定性。3．大分子修饰剂产生的空间障碍遮盖酶活性部位或敏感键，增加酶抗抑制剂、抗蛋白水解酶的能力。4．修饰可破坏抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低或消失。7.1.2．酶化学修饰的内在机制及原理☆酶分子化学修饰的基本要求1．酶性质的了解2．修饰剂的选择3．修饰反应条件的选择4.修饰反应的定性定量检测1．酶性质的了解1．酶活性部位情况2．酶的稳定条件、酶反应最适条件3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。2．修饰剂的选择1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。2．修饰剂上反应基团的数目及位置。3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。3．修饰反应条件的选择1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例。2．反应体系的pH条件、溶剂性质，离子强度。3．反应温度及时间。4.修饰反应的定性定量检测需建立适当的方法对反应进程进行跟踪，获得一系列有关修饰反应的数据；以确定修饰程度和部位。间接分析法，被修饰的残基经分离纯化后，通过其含有的同位素标记量或有色修饰剂的光谱强度、荧光标记量来测定反应程度。对修饰部位进行鉴定，需要被修饰的酶蛋白经总降解和氨基酸分析。7.1.1—7.1.2小结化学修饰原因酶修饰的方向基本原理酶分子化学修饰的基本要求1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．酶的主要动力学性质的不适应。3．体外的反应条件不在其最适反应条件范围内。4．临床应用的特殊要求不符合。核酸水平蛋白质水平1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．酶表面形成缓冲外壳，抵御外界环境，维护酶活性部位稳定性。3．大分子修饰剂产生的空间障碍遮盖酶活性部位或敏感键，增加酶抗抑制剂、抗失活因子能力。4．修饰可破坏抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低或消失。酶性质的了解修饰剂的选择修饰反应条件的选择修饰反应定性定量检测7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联1.酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链上有各种不同的活泼功能基团，可与一些试剂发生化学反应，达到对酶分子进行化学修饰的目的。一．几种重要的修饰反应二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰三.研究新热点（扩展）一．几种重要的修饰反应1．酰化反应酶分子侧链基团的酰化反应2．烷基化反应修饰剂特点：带有活泼的卤素原子，卤素原子的电负性使烷基带有部分正电荷，容易导致酶分子的亲核基团发生烷基化。亲核基团：亲近核的基团,核,来自于原子核这个概念，带正电。即：亲近正电荷的基团，据异性相吸，这样的基团带负电荷。2,4-二硝基氟苯碘乙酸3．氧化和还原反应具有氧化性的试剂，能将侧链基团氧化（在修饰反应中要控制好反应条件，以免强氧化剂使肽链发生断裂）受氧化反应作用的侧链基团：巯基，硫醚基，咪唑基，酚基还原剂：β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（主要作用于酶分子中二硫键的修饰试剂）酶分子中巯基的可逆保护反应（连四硫酸钠或连四硫酸钾）4．芳香环取代反应四硝基甲烷酶分子酪氨酸残基的酚羟基在苯环3和5位上容易发生亲电取代的硝化和碘化反应3-硝基酪氨酸衍生物，具有特殊光谱，用于直接的定量测定二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰

酶分子侧链上的功能基团：氨基，羧基，巯基，咪唑基，胍基，吲哚基，酚基，羟基，硫醚基，二硫键。1．氨基的化学修饰--赖氨酸侧链ε-氨基是酶分子中亲核反应活性很高的基团。

2．羧基的化学修饰3．巯基的化学修饰：具有很强的亲核性专一性强的巯基修饰剂最常用的定量酶分子中巯基数目的修饰剂（Ellman试剂）可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感型融合蛋白受体；定位在高尔基体中，通过膜泡融合调节内体运输。4．咪唑基的化学修饰5．胍基的化学修饰6.二硫键的化学修饰β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）三.研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧链基团修饰：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团，主要是核糖2’-位置上的羟基以及嘌呤、嘧啶碱基上的氨基。方法：核苷酸置换修饰2’-位置上的羟基去除接上氨基酸等有机化合物7.1.3结束重要的修饰反应特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰酰化反应烷基化反应氧化和还原反应芳香环取代反应氨基的化学修饰羧基的化学修饰巯基的化学修饰咪唑基的化学修饰胍基的化学修饰二硫基的化学修饰1.酶分子侧链基团的化学修饰7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联酶分子的亲和标记亲和标记概念：利用酶和底物亲和性，使用与酶底物结构类似的修饰剂，专一性共价结合到酶分子活性部位氨基酸残基上，是位点专一性的化学修饰。（只对特定部位的特定基团进行共价标记。）专一性不可逆抑制Ks型不可逆抑制（亲和标记）Kcat型不可逆抑制：底物的类似物，但结构中潜藏着一种化学活性基团，酶与底物类似物结合，酶促催化作用进行到一定阶段以后，潜在的化学基团被暴露、活化，和酶活性中心发生共价结合，使酶失活。该过程为酶的“自杀”。自杀性底物：青霉素亚砜7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联有机大分子对酶的修饰概念：利用水溶性和生物活性的大分子与酶通过共价键结合，使酶的结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能；特点：这些水溶性和生物活性大分子不能直接与酶分子上的基团反应，使用之前需进行活化常用的大分子修饰剂聚乙二醇☆☆右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽☆具有生物活性的大分子物质☆☆聚乙二醇（PEG）用的最多的一类修饰剂；特点：溶解度高，没有免疫原性和毒性；应用：采用只带有一个可被活化羟基聚乙二醇（MPEG）：MPEG三氯均嗪类衍生物（7-15,7-16）用聚乙二醇修饰过的超氧化物岐化酶，可降低或消除酶的抗原性，提高抗蛋白水解酶能力，延长酶在体内半衰期时间，从而提高酶的药效。聚乙二醇分子式糖肽来源：通过蛋白水解酶降解纤维蛋白或γ-球蛋白得到；糖肽上的氨基经活化后，与酶分子中的氨基反应，以共价键结合，实现对酶的修饰；戊二醛法活化糖肽之后，进行酶的修饰具有生物活性的大分子物质

—蛋白质类修饰血浆蛋白质是血浆的天然组分；分子质量比较大；其中人血清白蛋白应用较多的酶修饰剂。常用修饰方法1．戊二醛法：戊二醛双功能基团☆2．碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联剂3．活性酯法：☆☆戊二醛法利用戊二醛双功能基团的活泼性，使白蛋白和酶分子上的氨基发生交联而对酶进行修饰。活性酯法（1）原理：根据多肽合成原理发展起来（2）特点：反应条件温和，减少了修饰反应中副反应的产生。（3）工艺步骤：活性酯法介导白蛋白修饰酶的反应过程：

a白蛋白琥珀酰化b活性酯形成反应c修饰反应大分子结合修饰

概念常用的水溶性和生物活性大分子修饰剂举例：聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质聚乙二醇结合修饰SOD7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联交联剂：具有两个活性反应基团的双功能试剂，可在酶分子内相距较近的两个氨基酸残基直接形成共价交联，使酶分子空间构象更稳定。交联酶晶体制备扩充知识点—金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。常用的离子：大都是二价金属离子。α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+），超氧化物岐化酶分子中的铜、锌离子（Ca2+、Zn2+）从酶分子中除去其所含的金属离子，酶会丧失催化活性。重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可恢复。若用另一种金属离子进行置换，可使酶呈现不同的特性：酶的活性降低或增加。举例将基质金属蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。应用：只是适用于在分子结构中本来含有金属离子的酶。金属离子置换修饰的过程除去原有的金属离子：加入金属螯合剂EDTA，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物。通过透析、超滤等将EDTA-金属螯合物从酶液中除去，此时，酶称为无活性状态。加入置换离子：去离子的酶液中加入另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，得到置换后的酶。定义：在较温和条件下，以可控方式使酶同某些化学试剂发生特异反应，从而引起酶分子中某些基团发生共价的化学改变的过程（狭义）。7.1.1—7.1.2小结化学修饰原因酶修饰的方向基本原理酶分子化学修饰的基本要求1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．酶的主要动力学性质的不适应。3．体外的反应条件不在其最适反应条件范围内。4．临床应用的特殊要求不符合。核酸水平蛋白质水平1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．酶表面形成缓冲外壳，抵御外界环境，维护酶活性部位稳定性。3．大分子修饰剂产生的空间障碍遮盖酶活性部位或敏感键，增加酶抗抑制剂、抗失活因子能力。4．修饰可破坏抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低或消失。酶性质的了解修饰剂的选择修饰反应条件的选择修饰反应定性定量检测7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联5.金属离子置换修饰化学修饰（广义）凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为酶蛋白的化学修饰（广义）。利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构和空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能。7.1.4化学修饰酶的特性1．热稳定性2．抗原性3．体内半衰期4．最适pH5．酶学性质的改变6．对组织的分布能力变化1．热稳定性原因：1．修饰剂存在多个活性反应基团，可与酶多点交联，稳定了酶的天然构象，增强了酶的结构刚性，不易伸展打开。2．减少了酶分子内部基团的热振动。热稳定性举例：例：过氧化氢酶：右旋糖酐：50℃/10min，40%-90%糜蛋白酶：右旋糖酐：37℃/6h，0%-70%糜蛋白酶：肝素：37℃/6h，0%-80%尿酸酶：人血清白蛋白：37℃/48h，50%-95%二．抗原性原因：组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决定簇的结构大分子修饰剂遮盖抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。3．体内半衰期体内半衰期延长酶在经化学修饰之后