临床生化检验技术

临床生化检验技术第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节电泳技术第四节层析技术第五节离心技术主要内容第一节光谱分析技术一、光谱技术的分类二、分光光度技术的基本原理三、分光光度计的基本结构四、分光光度计的操作方法五、分光光度技术的定性和定量方法六、火焰光度法七、其他光谱技术

3光谱分析技术原理：

利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和

荧光光谱法吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子

吸收分光光度法和红外光谱法散射光谱分析技术:

比浊法

一、光谱技术的分类4二、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I

当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T=I/I0T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：5（二）Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：A=KLC

式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度（Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）6

据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。7（三）偏离Lambert-Beer定律的因素

应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学和化学两方面的因素。1．光学因素：

要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。

2．化学因素：

浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。

8三、分光光度计的基本结构最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计

光源单色器比色杯检测器显示器五大部份结构：9（一）光源光源定义：

指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。光源种类：可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。

紫外光光度计常用氢灯作为光源。10（二）单色器定义：

将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。种类：滤光片棱镜光栅11（三）比色杯又称为吸收池或比色皿材料：常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成

（五）显示器（四）检测器

检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。

是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。12四、分光光度计的操作方法（一）分光光度计的基本操作以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。2.将波长旋至测定的波长。3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为。5.将开关置于A，用消光调零调节A为6.重复步骤4和57.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）13（二）吸光度的校正

铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。14五、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法定性依据：最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε2.摩尔消光系数ε方法1.最大吸收波长λmax方法15（二）分光光度技术的定量方法1.标准曲线法

根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。方法：16制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。（2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。（3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。172．比较法Cu=(Au×Cs)/As

己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：

其中Cu和Au为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。183．其它分析方法

包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。19六、火焰光度法(一)概述(二)仪器装置(三)定量分析原理(四)定量分析的方法(五)影响火焰光度法分析结果的因素(一)概述1、火焰光度法的定义火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分析法。

2、火焰光度法的特点④设备简单：被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单。⑤应用范围窄：主要用于碱金属和部分碱土金属的测定。①快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。②准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5％，可用于微量分析和常量分析。③灵敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0．1～10×10－6g。(二)仪器装置FP640火焰光度计

火焰光度法分析示意图1.光源系统2.光学系统3.检测系统

-用于测定食品中的钠含量、土壤中的钾含量、矿石中的钠／钾含量等。

-可同时测定钠、钾离子浓度。-数据可以通过RS-232接口输出到计算机或打印机。

-测量范围：钠0-199.9ppm

钾0-9.99ppm

锂0-9.99ppm

-灵敏度：钠；K=100单位

-重现性：小于％C.V.双通道火焰光度计仪器装置①光源：包括喷雾器、雾化室和喷灯。试液经喷雾器分散在压缩空气中成为雾，然后与可燃气体混合，在喷灯上燃烧，待测组分被激发发射谱线。②光学系统：包括滤光片、光栅等，目的在于分离不需要的谱线，让被测元素灵敏线通过。仪器装置③常用的灵敏线是：锂670.8nm(红)，钠589.3nm(黄)，钾766.5nm(暗红)，钙422.7nm(砖红)。④检测系统：光电池(或光电管)和检流计。(三)定量分析原理火焰光度法的定量原理与发射光谱相同。即：试样受激发后发射的谱线强度

I与试样浓度C成正比，

I＝aCb式中a是一个常数，b为自吸常数。当溶液浓度较低，自吸常数b≈1，则上式便可表示为

I

＝aC

I可通过光电池转为光电流而被测量。(四)定量分析的方法火焰光度法谱线简单，干扰少，激发条件稳定，一般不采用谱线相对强度测量法，而直接在检流计上读出谱线绝对强度I，采用校正曲线法进行定量测定。但须注意：由于自吸收在高浓度时比较严重地导致校正曲线的弯曲。1、校正曲线法2、比较法火焰光度法的定量也可以采用比较法，步骤如下：①配制两个浓度与试样浓度相近而分别比试样浓度稍大和稍小的标准试液，②设其浓度分别为C1、C2

，试样浓度为CX

，③分别测得相应的检流计读数为α1、α2和αX，④则可通过下式求得样浓度：(五)影响火焰光度分析的因素1、激发条件：火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。影响火焰温度的因素有：①燃气种类：一般认为采用丙烷-空气或液化石油气-空气等低温火焰(约1900℃)较为合适和方便；②适当的燃气与助燃气比例③试样溶液提升量(毛细管每分钟吸入喷流液毫升数)过大时会使火焰温度下降。

元素的电离和自吸收可导致校正曲线弯曲，线性范围缩小。如钾在高浓度时自吸收严重，使校正曲线向横坐标方向弯曲；在低浓度时则由于电离增加，辐射增强，校正曲线向纵坐标方向弯曲。2、试样的种类和组成电离和自吸收对钾校正曲线的影响(五)影响火焰光度分析的因素3、试液中共存离子对测定有影响，如碱金属共存时谱线增强，使结果偏高。4、仪器的质量单色器的质量好，可减少共存物质的干扰，如采用较好的干涉滤光片时，5×10-6g/L的A12O3、Fe2O3、MgO或CaO均不影响K、Na的测定。但如使用质量差的滤光片，则1×10-4g／L的CaO也将使Na的辐射强度急剧增加，影响测定的准确性。七、其它光谱分析技术（一）原子吸收分光光度法（二）荧光光度分析法1．基本原理2．组成3．原子吸收分光光度法的特点

3．荧光光度定量分析法4．荧光光度分析技术的应用1．基本原理2．影响荧光强度的因素33第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节电泳技术第四节层析技术第五节离心技术主要内容第二节电化学分析一、电化学分析法概述二、化学电池与电极电位三、电极与电极类别四、电极-溶液界面的传质与极化一、电化学分析法概述应用电化学的基本原理和实验技术，依据物质的电化学性质，在溶液中有电流或无电流的情况下，来测定物质组成及含量的分析方法称之为电化学分析法。（一）电化学分析法电化学性质化学性质关系

电流、电位、电导、电量组成、浓度、形态、某些化学变化一、电化学分析法概述（二）电化学分析法特点1.灵敏度、准确度高，选择性好2.电化学仪器装置较为简单，操作方便某些方法，检出限可达10-12mol/L数量级化工生产中的自动控制和在线分析。3.应用广泛无机离子分析；有机电化学分析；药物分析；活体分析。一、电化学分析法概述（三）电化学分析法分类电位分析法电解分析法库仑分析法极谱与伏安分析法电导分析法电化学分析法二、化学电池与电极电位（一）化学电池（二）电极电位（三）液体接界电位与盐桥二、化学电池与电极电位（一）化学电池化学电池由两支电极和电解质溶液构成，将化学能与电能进行相互转换装置。化学能相互转化电能外电源提供电能电解池自发进行原电池1、化学电池概念二、化学电池与电极电位原电池和电解池示意图二、化学电池与电极电位

当电池工作时，电流通过电池的内外部，构成回路。外部电路：金属导体，带负电的电子。内部电路：电解质溶液，带正、负电的离子。两电极的金属/溶液界面上发生氧化-还原电极反应，即离子从电极上取得电子或将电子交于电极。二、化学电池与电极电位几个基本概念阳极：发生氧化反应的电极；阴极：发生还原反应的电极。正极：电位高的为电极；负极：电位低的为电极。二、化学电池与电极电位阳极=负极阴极=正极阳极=正极阴极=负极二、化学电池与电极电位（二）、电极电位1、电极电位与能斯特方程电极电位：当金属插入到相应的金属盐溶液中时，在电极上形成的电位。

形成机理：金属和溶液化学势不同---金属与溶液带有不同电荷----双电层----电位差---产生电极电位。（1）电极电位二、化学电池与电极电位（2）能斯特方程对于任意给定的电极，电极反应为Ox+ne-→Red能斯特方程电极电位：

二、化学电池与电极电位2、电极电位的测量、标准电极电位与条件电极电位（1）电极电位的测量单个电极的绝对电极电位无法测定；相对电极电位。标准氢电极||待测电极标准氢电极与待测电极组成原电池，利用对峙法测定：二、化学电池与电极电位（2）标准电极电位

298.15K,以水作溶剂，氧化态和还原态的活度均为1时测定某电极的电极电位。

（3）条件电极电位考虑溶液的离子强度、配位效应、沉淀、水解、PH等影响条件电极电位二、化学电池与电极电位3、液体接界电位与盐桥产生原因：在两种溶液的界面之间，离子由浓度高的一方的离子向浓度低的一方扩散。且不同离子扩散速率不同。液体接界电位：在两种不同离子的溶液或两种浓度不同的溶液相接触的界面间所存在的一个微小的电位差。二、化学电池与电极电位(a)(b)(c)盐桥：饱和KCl溶液中加入3%琼脂。

K+、Cl-的扩散速度接近，液接电位保持恒定1-2mV。三、电极与电极类别电极分类

按电极在测量过程中的作用

指示电极参比电极按工作性质辅助电极工作电极按电极特性金属电极惰性电极微电极膜电极化学修饰电极三、电极与电极类别（一）参比电极（二）指示电极三、电极与电极类别指示电极：电极电位随被测溶液中待测离子活度的变化而改变，即能够指示溶液中待测离子活度的变化。参比电极：电极电位不随测量对象的不同和活度的变化而发生改变，即保持恒定。参比电极与指示电极主要用于溶液本底浓度不发生变化的体系，如电位分析。三、电极与电极类别（一）参比电极参比电极

标准氢电极甘汞电极银-氯化银电极1、标准氢电极

任何温度下，标准氢电极的电极电位为零。是测定所有电极的电极电位的基准。电极反应：半电池符号：电极电位：三、电极与电极类别2、甘汞电极

铂丝浸入汞-氯化亚汞的糊状物中，以氯化钾溶液做内充液。电极反应：半电池符号：电极电位(25℃)：三、电极与电极类别甘汞电极的电极电位（25℃）一定温度下，电极内溶液的Cl-活度保持恒定，甘汞电极电位恒定。三、电极与电极类别3、银-氯化银电极

银丝镀上一层AgCl沉淀，浸在一定浓度的KCl溶液中。电极反应：半电池符号：电极电位(25℃)：三、电极与电极类别银-氯化银电极的电极电位（25℃）三、电极与电极类别（二）指示电极指示电极的结构和原理第一类电极—金属-金属离子电极第二类电极—金属-金属难溶盐电极第三类电极—汞电极第四类电极—惰性电极第五类电极—膜电极三、电极与电极类别1、第一类电极—金属-金属离子电极（M|Mn+）将某种金属插入该金属离子的溶液中。金属银、铜、锌、汞等。Mn++ne-→M电极反应：电极电位为(25℃)：

阳离子指示电极三、电极与电极类别2、第二类电极—金属-金属难溶盐电极（M|MXn）在金属电极表面覆盖一层该金属的难溶盐，并将该金属电极插入含有该金属难溶盐的阴离子溶液中。二个相界面：金属与金属难溶盐、金属难溶盐与溶液。三、电极与电极类别电极电位为(25℃)：MXn+ne→Mn++nX电极反应：

阴离子指示电极用于与电极离子产生难溶盐的阴离子的指示电极。最重要的应用是作指示电极三、电极与电极类别3、第三类电极—汞电极

金属汞浸入含有少量Hg2+-EDTA配合物及被测金属离子的溶液中所组成