项目一-核酸的生产精讲学习资料

项目一--核酸的生产精讲核酸的化学组成1.核酸的元素组成：组成核酸的主要元素有：C、H、O、N、P等，其中P的含量最大，约占总量的9%~10%。2.核酸的基本组成单位：核苷酸（单核苷酸）RNA和DNA都是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链，核苷酸是由戊糖、磷酸和含氮碱基三类成分构成的。1.一般性质（核酸的分子大小、形状、黏度、溶解度）2.核酸的酸碱性3.核酸的变性、复性和分子杂交：4.核酸杂交：核酸的物理化学性质核酸的水解产物：核酸核苷酸磷酸核苷戊糖核糖脱氧核糖含氮碱嘌呤碱嘧啶碱核酸的生理功能基因的核苷酸序列决定了蛋白质的氨基酸序列，同时核酸还可自我复制传递给子代，因此在每个生物体中，核酸是遗传信息的载体和各种生命活动信息指令的根本来源。中心法则：第二章核酸的制备和应用制备途径及选择材料：有三种途径，分别是从生物组织中直接分离提取、选育高产核酸类物质的微生物菌种通过发酵法制得、化学合成。应用较多的主要是前两种。大多数核酸在细胞中是以蛋白质结合的状态存在，因此在制备核酸时要将它雨蛋白质分离开。选材：选用生长较旺盛的组织，如胰、脾、胸腺等，这类组织比同样体积的其他组织，如肌肉等组织含有更多的细胞数，核酸的含量较高。

核酸制备的基本步骤破碎细胞提取纯化核酸分离纯化的一般原则1.保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构与功能的最基本要求。2.排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。核酸的提取、分离纯化从动植物组织和微生物中提取核酸一般原则是首先要破碎细胞，提取核蛋白，然后把核酸和蛋白质分离，再沉淀核酸进行纯化。核酸属于大分子化合物，具有复杂的空间三维结构，为了使得到的核酸保持天然状态，在提取分离是要注意避免强酸、强碱对核酸的降解，避免高温、机械剪切力对核酸空间结构的破坏，操作时在溶液空间中加入核酸酶抑制剂，整个操作过程要在低温（0°C左右）条件下进行，同时还要注意避免剧烈的搅拌。包括：1）核蛋白的提取2）核蛋白中蛋白质的去除3）核酸的分离纯化核酸含量的测定方法及原理1．紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收高峰在260nm波长处。一般在260波长下，每1毫升含1µgRNA溶液的光吸收值为0.022，每1毫升含1µgDNA溶液的光吸收值约0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简单、迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。2.定磷法核酸分子结构含有一定比例的磷（RNA的含磷量约8.5%~9.0%，DNA含磷量约9.2%）测定其含磷量即可求出核酸的量。核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下，无机磷与钼酸铵结合成黄色磷钼酸铵沉淀，当有还原剂存在时，Mo从+6被还原为+4价，+4价的Mo再与试剂中的其他MoO4结合成Mo(MoO)2或Mo3O8,呈蓝黑色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需做对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。3．定糖法（1）地衣酚显色法测定RNA含量:RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3,5—二羟基甲苯（地衣酚，苔黑酚）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收值。当RNA浓度为20~250µg/ml时，光密度与RNA度成正比。（2）二苯胺法测定DNA含量

DNA分子中有2—脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2—脱氧核糖并形成ω－羟基－ϒ－酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40~400µg范围内时，光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。第三章RNA和DNA的提取及测定一、RNA的提取和含量测定由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室中最常见的。组织匀浆用苯酚处理离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。酵母含RNA达2.67~10%，而DNA含量仅为0.03~0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA含量的测定，多以地衣酚法。制取方法1、材料：干酵母粉2、试剂：0.2%NaOH溶液，0.05mol/LNaOH溶液，乙酸，95%乙醇，无水乙醚。3、器材：容量瓶、吸量管、量筒（10,50mL）、沸水浴、离心机、布氏漏斗、抽滤瓶、石蕊试纸。4、操作流程酵母RNA提取称4g干酵母粉置于100mL烧杯中，加入40mL0.2%NaOH溶液，沸水浴加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），4000r/min离心10~15min.取上清液，加入30mL95%乙醇，边加边搅动，后静置，待RNA沉淀完全后，布氏漏斗抽滤。滤渣先用95%乙醇洗两次，每次用10mL。再用无水乙醚洗两次，每次10mL，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后再用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量。RNA地衣酚显色测定标准曲线的制作：去12支烘干试管，按下表编号及加入试剂。平行做两份。毕置沸水浴加热25分钟，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。 试管编组（x2）

试剂012345标准RNA溶液/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.61.20.80.40.0地衣酚—Cu2+/mL2.02.02.02.02.02.03）、样品的测定

取2支试管，各加入2.0

ml样品液，再加2.0

ml地衣酚—Cu2+试剂，如前述进行测定。4）、RNA含量的计算根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量：

待测液中测得的RNA含量（µg/mL）*100%RNA%=待测液中制品的含量（µg/mL）二、DNA的提取和含量测定

DNA主要集中在细胞核内，因此通常选择细胞核含量比例大的生物组织作为提取纸杯DNA的材料。本实验中选取猪肝作为实验材料，用浓盐法法制备DNA。制取方法1.材料：新鲜的猪肝2.试剂：0.1mol/LNaCL-0.05mol/L柠檬酸钠混合液0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂操作流程1）取新鲜的猪肝，称20g，剔除结缔组织，用0.1mol/LNaCl、0.05mol/L柠檬酸钠溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2）加入2倍组织重的0.1mol/LNacl、0.05mol/L柠檬酸钠混合液（40mL）置高速组织捣碎机内破碎细胞膜，获得组织浆液。3）组织浆液于3000r/min离心15min，弃去上层液，收集沉淀（包括细胞核）。4）向细胞核沉淀中加入6倍组织重的10%（1.71mol/L）NaCl溶液120mL,充分搅匀，置冰箱内过夜。5）次日将所得的半透明粘稠状液体连续注入预冷的11倍体积（1320mL）蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP（脱氧核糖核蛋白）即呈絮状沉淀析出，置于冰箱内放置数小时。6）上层清夜利用虹吸法析出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心（3000r/min,10min）,收集DNP沉淀。7）将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积（80mL）的10%NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解。8)加入1/2体积的氯仿-异戊醇溶液40mL，上下剧烈震荡10min，使组蛋白分离，于3000r/min，离心10min。析出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。9）上层水再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提取出蛋白质，多次重复操作直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。10）最后吸出上清液并将它连续注入体积预冷至4°C的95%乙醇中。11）用玻璃棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80%~95%乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维状的DNA钠盐。二、DNA含量的测定1）标准曲线的制定取14只试管，分成7组按下表操作

1234567DNA含量/µg04080160240320400DNA标准溶液/mL00.20.40.81.21.62.0蒸馏水/mL2.01.81.61.20.80.40二苯胺试剂/mL4.04.04.04.04.04.04.0混匀，60°C恒温水浴保温1h，冷却后595nm处比色A595

每组取两管光吸收平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2）样