微生物的实验室培养

微生物的实验室培养学习目标：巩固培养基的基础知识归纳总结微生物培养和无菌技术的操作方法利用相关知识解决实际问题考点一培养基【基础知识整合】1．培养基的定义：人们按照微生物对

的不同需求，配制出供其

的营养物质。2．类型：培养基按照

可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂

后，制成琼脂固体培养基，是实验室最常用的培养基之一。微生物在固体培养基表面生长，可以形成

的

。营养物质生长繁殖物理性质琼脂肉眼可见菌落液体琼脂菌落活菌计数保藏菌种明确分类鉴定青霉素高浓度食盐指示剂化学药品3．营养物质：各种培养基一般都含有水、____源、____源和无机盐四种营养物质。碳氮微生物类型碳源氮源能源大肠杆菌硝化细菌根瘤菌固氮蓝藻糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物CO2糖类等有机物CO2NH3N2N2NH3有机物光能几种微生物的营养能量来源满足微生物生长还需要适宜的____(培养霉菌时需要将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至____或____性)、氧气的要求(根据微生物的需求提供有氧或无氧环境)、

物质(如培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加

等)。pH中性微碱特殊营养维生素【典例精析】1.下列关于培养基的叙述，错误的是()A．硝化细菌能以NH3作为氮源和能源物质B．各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质C．特殊营养物质是某些微生物生长过程中需要额外补充的营养物质D．培养乳酸杆菌时培养基中不需要添加维生素D2．牛肉膏可以为微生物提供的主要营养是()A．氮源和维生素B．氢元素和氧元素C．碳源、磷酸盐和维生素D．无机盐C3．下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是()A．在缺乏碳源的培养基中的硝化细菌B．在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌C．在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌D．在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒A4.甲、乙、丙为三种微生物，下表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是(

)培养基粉状硫10gK2HPO44gFeSO40.5g蔗糖10g(NH4)2SO40.4gH2O100mLMgSO49.25gCaCl20.5gⅠ＋＋＋＋－＋＋＋Ⅱ＋＋＋－＋＋＋＋Ⅲ＋＋＋＋＋＋＋＋A.甲、乙、丙都是异养微生物B.甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物C.甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物D.甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物D考点二无菌技术【基础知识整合】1．获得纯净培养物的关键是防止外来

的入侵，要注意以下几个方面：①对实验操作的

、操作者的

和____进行

和

。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行

。③为避免周围环境中微生物的污染，

应在酒精灯

进行。④实验操作时应避免

处理的材料用具与

的物品相接触。杂菌空间衣着手清洁消毒灭菌实验操作火焰附近已经灭菌周围2．消毒与灭菌的区别消毒指使用较为

的

或

方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体

的微生物(不包括

和

)。消毒方法常用

消毒法，还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸、煤酚皂等)消毒、

消毒、

消毒法。灭菌则是指使用

的理化因素杀死物体内外

的微生物，包括

和

。灭菌方法有______灭菌、

灭菌、

灭菌。温和物理化学有害芽孢孢子煮沸紫外线强烈所有芽孢孢子灼烧干热高压蒸汽巴氏【知识拓展】1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。培养细菌用的培养基与培养皿、玻棒、试管、烧瓶和吸管需要灭菌；实验操作者的双手需要消毒。2．消毒与灭菌的比较比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能【典例精析】1.请回答下列与微生物培养有关的问题：

(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑

、

和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、

、

等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行

(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和

；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能

。温度酸碱度易培养生活周期短灭菌消毒损伤DNA的结构【方法归纳】①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。2．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧几种不同的灭菌处理，这些方法可依次用于杀灭哪些部位的细菌()A．接种针、手、培养基B．手、培养基、接种针C．培养基、手、接种针D．接种针、培养基、手C3.防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(

)A.实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒B.接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰

部位灼烧灭菌C.在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定

要洗手，以防止被微生物感染D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染

环境B4．某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料：

、

、

、

、

。其中提供氮源的是

。牛肉膏蛋白胨水无机盐琼脂蛋白胨、牛肉膏(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入

中灭菌，压力100kPa，温度

，时间15～30min。灭菌完毕后拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应

。(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入

，把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。高压蒸汽灭菌锅121℃废弃适量水5.下列实验材料和用具，适合使用消毒方法的是__________，适合使用灭菌方法的是____________。①培养基②外植体③操作者双手④锥形瓶⑤接种环⑥牛奶⑦工作台⑧培养皿②③⑥⑦①④⑤⑧牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。1.下表是牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分，请说出各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0gH2O定容至1000mL氢元素、氧元素碳源、氮源，磷酸盐和维生素碳源，氮源和维生素无机盐制备培养基2.完成下面的实验过程(1)培养基的配制计算：依据培养基

的比例，计算各成分的用量配方称量0.5g牛肉膏：比较粘稠，用

称取1g

：易吸潮，要0.5gNaCl2g称量纸蛋白胨迅速称取琼脂溶化烧杯＋少量↓微火加热、不断搅拌溶化后加

(不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底,

而导致烧杯破裂)熔化后，补加蒸馏水至

mL蒸馏水琼脂100

:1moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4~7.6调节pH

：趁热分装到洁净锥形瓶中加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水包扎：外包

纸，且挂标签分装牛皮(2)灭菌注入开水：与底架平齐放待灭菌物品：

放于灭菌桶中，不要太挤加盖密封竖排冷空气：打开排气阀，排除锅内高压灭菌：关上排气阀，压力升至

kPa，温度为

℃，维持15～30min取出灭菌物品：断电后，压力降至

时，打开排气阀，

旋松螺栓，取出灭菌物品冷空气1001210(3)倒平板待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行：①在火焰旁

手拿锥形瓶，

手拔出棉塞(如图1)。右左②使锥形瓶的瓶口迅速通过

，目的是进行

防止瓶口微生物污染培养基(如图2)。火焰灭菌③

手将培养皿打开

，

手将培养基倒入培养皿，立刻盖上

(如图3)。左一条缝隙右皿盖④待平板

后，将平板

放置(如图4)。冷却凝固倒过来3.培养基的选择：培养基配制好后，要放在

中保温1～2d，若

则说明制备的培养基是合格的。4.平板冷凝后，要将平板倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基

，又可以防止

。恒温箱无菌落生长表面的水分更好地挥发皿盖上的水珠落入培养基，造成污染【知识拓展】1．倒平板操作的注意事项(1)培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。我们可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。(2)通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，最好不要用这个平板培养微生物。1.下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，叙述错误的是(

)A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B.将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C.待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板D.待平板冷却凝固约5～10min后，将平板倒过来放置活学活用A2.下列叙述错误的是(

)A.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为

避免污染需放在酒精灯火焰附近B.倒平板整个过程应在火焰旁进行C.打开培养皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培

养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置C纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由

繁殖而来，这就需要接种时尽量接种单个的大肠杆菌，最常用的是

法和

法。一个大肠杆菌平板划线稀释涂布平板纯化大肠杆菌1.平板划线法平板划线法是通过

在琼脂固体培养基表面

的操作。接种环连续划线操作将

放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的将试管口通过酒精灯的将已冷却的接种环伸入菌液中，

一环菌液接种环棉塞沾取火焰操作示意图操作将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞

将培养皿皿盖打开

，

将沾有菌种的接种环迅速伸入

，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基灼烧接种环，冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将

的划线与

相连将平板

，放入培养箱中培养左手一条缝隙右手平板内最后一区第一区倒置平板划线操作的注意事项(1)操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。(3)做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这是因为划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法结合示意图，完成下面步骤：(1)系列稀释操作①将分别取盛有9mL水的6支试管

，并按101～106的顺序编号。②用

吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使

。③从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得

倍液。依此类推。灭菌移液管菌液与水充分混匀102(2)涂布平板操作操作示意图3.菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。保存时间保存方法具体方法后续处理频繁使用

法将菌种接种到试管的

培养基上，培养，长成菌落后，放入的冰箱中保藏每

个月需重新接种。否则菌种容易被污染或产生变异临时保藏固体斜面4℃3～6长期保存

法在

mL甘油瓶中，装入

mL甘油后灭菌，将

mL菌液转移到甘油瓶中与甘油充分混合放入

的冷冻箱中保存甘油管藏311－20℃将菌种放在低温环境中保藏的目的是

。降低微生物的新陈代谢速率【典例精析】【例3】(2011新课标)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从被污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以

为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于

培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即

和

。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力

。原油选择平板划线法稀释涂布平板法强(4)通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌法、

和

。无菌技术要求实验操作应在酒精灯

附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。干热灭菌法高压蒸汽灭菌法火焰1．下列关于培养基的叙述，错误的是()A．碳源、氮源、无机盐、水等是微生物生长不可缺少的营养要素B．根据微生物对碳源需要的差别，使用不同碳源的培养基C．可在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，用于维持pH的相对稳定D．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌D2．有关稀释涂布平板法，叙述错误的是()