蛋白质实验技术教案资料

蛋白质实验技术..课程内容：介绍蛋白质性质、表达、分离、纯化以及鉴定过程中所涉及到的基本技术的基本原理、应用范围及注意事项。主要参考书：1『生物化学』－面向21世纪课程教材（第三版）

王镜岩,朱圣庚,徐长法主编高教出版社2『蛋白质技术手册』

汪家政，范明主编科学出版社3『生物化学与分子生物学实验常用数据手册』吴冠芸，潘华珍，吴恽主编科学出版社4『蛋白质纯化指南』（第二版）

R.R.伯吉斯,M.P.多伊彻编著陈薇主译科学出版社5『蛋白质分析实验技术指南』李玉花主编科学出版社第一章绪论牛胰岛素人源葡萄糖转运蛋白GLUT1牛胰岛素提出---1958年与美、德科研小组同时独立提出这一课题背景---1958年，没有不可征服的科学高峰初期：短暂的正常研究阶段（已获得拆、合天然胰岛素等几项重要的成果。）

牛胰岛素高潮：混乱的大兵团作战（正常的科研程序被严重干扰；对参与研究的人员造成了很大的身体伤害）苦撑：北大最少时只剩下两个科研人员攻关：各单位放弃内部竞争通力协作，终于结出硕果。诺贝尔奖？

1923年，班丁(F．G．Banting)和麦克劳德(J．J．R．Mac．1eod)因为发现胰岛素和使用胰岛素治疗糖尿病而荣获了医学和生理学诺贝尔奖；1955年，维格纳奥德因为合成多肽激素催产素而获得诺贝尔化学奖；1958年，桑格因为分离和确定胰岛素的氨基酸组分的构成而荣获诺贝尔化学奖；1972年，安芬森(C．B．Anfinsen)等人因为发现氧化被还原的核糖核酸酶肽链能恢复活力而获得诺贝尔化学奖；1984年，梅里菲尔德(R．B．Merrifleld)因为发明固相合成方法而获得诺贝尔化学奖。葡萄糖转运蛋白细胞的葡萄糖摄取通道易化扩散与糖尿病的关系与肿瘤的关系Mueckler,M.etal.Science229,941–945(1985)Amann,T.&Hellerbrand,C.ExpertOpin.Ther.Targets13,1411–1427(2009)葡萄糖是地球上各种生物最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质。须依靠转运蛋白这个“运输机器”来完成1，催化剂－酶（碳酸酐酶）2，结构成分－胶原蛋白3，贮藏功能－麦醇溶蛋白（小麦种子）4，运输功能－血红蛋白（氧分子），跨膜运输5，运动功能－肌肉收缩，细菌鞭毛6，激素－胰岛素，生长激素7，防御（免疫）－抗体（免疫球蛋白）8，接受、传递信息－视觉，味觉9，调节生长发育蛋白质主要功能功能紊乱导致的疾病导致：婴儿癫痫发作、Fanconi-Bickel综合症、糖尿病、肥胖

Thorens,B.&Mueckler,M.Glucosetransportersinthe21stCentury.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.298,E141–E145(2010)功能紊乱导致的疾病GLUT1功能完全缺失将致死GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。Macheda,M.L.,Rogers,S.&Best,J.D.Physiol.202,654–662(2005)饿死癌细胞？结构解析酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有正常的活性、构象技术难度较大、耗时、耗资大肠杆菌表达系统实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体原核细胞表达系统

真核细胞表达系统表达系统结构解析LinfengSun，etal.2013.Nature.2013年清华大学的颜宁教授课题组报道了人的葡萄糖转运蛋白GLUT1-4在大肠杆菌中的同源蛋白XylE的晶体结构，并且运用生化手段对其工作机理进行了研究。人源葡萄糖转运蛋白GLUT1葡萄糖是地球上各种生物最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质。须依靠转运蛋白这个“运输机器”来完成GLUT1对健康的影响GLUT1功能完全缺失将致死GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。GLUT1对健康的影响GLUT1功能完全缺失将致死GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。团队：这项具有里程碑意义的科研成果是由一个清华大学的年轻团队完成的，第一作者邓东博士为80后，三位共同第一作者都是90后。细胞培养提纯蛋白蛋白结晶不要把你纯粹的思想浪费在不纯的酶上！---EfraimRacker经典酶学方法：20世纪初无细胞条件下蔗糖乙醇---EduardBüchner从现象追踪到功能（乙醇发酵、糖酵解等）为什么要纯化酶？目录主要仪器介绍和安全规范蛋白质样品制备蛋白质的表达与纯化蛋白质与其他物质的相互作用第一讲主要仪器介绍和安全规范离心机操作注意事项使用之前要仔细阅读说明书了解：最大转速、所需转头、温度。提前预约。操作：检查转头是否牢固固定检查盖是否完全吻合盖好提前预冷，预冷时要拧好盖严格配平操作过程若暂时不用要盖上机盖升速和降速过程要多加注意噪声大时要选择降速并联系老师离心机操作注意事项使用后：离心机使用完毕后，若有液体溅出要联系老师取出转子，清洁后倒置放在干燥、平稳的地方。转子清洁时只能用中性洗涤液，禁止用腐蚀性液体擦拭。使用致冷功能后在关闭电源时不要盖上离心机盖，应待离心机腔体内冷凝结的霜完全融化后，用干净的软布擦干水滴并充分晒干后再盖上离心机盖，否则会导致机器生锈。仪器断电后再开机应间隔3分钟以上，防止损坏压缩机。

离心机操作注意事项高压灭菌锅操作步骤1、确认电源的正确连接，将灭菌锅右侧的电源开关打开，然后按下“POWERON/OFF”键开机。2、确认锅内压力为0的情况下，轻轻向下按灭菌器盖的把手，脚踏盖锁解除踏板，把盖打开。向灭菌锅内注水(蒸馏水)直到看到水漫过底盘中心孔的横杠（大约需要2.0升水）。3、放置待灭菌的物品，盖上盖子到磁封条封好，将盖锁住。注意不要过满，不要有单独的小型颗粒。4、选择运行模式（一般均选择普通灭菌模式，选其他模式需要请示安全员）。高压灭菌锅操作步骤5、启动灭菌程序：（1）确定放气瓶内的水位在“HIGH”和“LOW”之间；（2）确定排水瓶内的水位足够低，不会碰到排气管的顶端；

（3）按“START/STOP”键启动灭菌程序。7、灭菌完成后，温度降至90度以下（锅内压力为0）的情况下才能打开盖子，拿出灭好的物品。8、按“POWERON/OFF”键断开电源。高压灭菌锅操作注意事项1.在压力到达0MPa之前，不打开灭菌器盖。2.压