Pyrosequencing技术及其应用

Pyrosequencing™Technology

-PyroMarkTMIDDNA分析系统JiabingCaoApplicationDepartmentGeneCompanyLtd关于BiotagePyrosequencing这项专利技术完全由Biotage公司拥有Biotage的前身即PyrosequencingAB成立于1997年，总部位于瑞典第三大城市Uppsala2003年并购另外两家公司后更名为BiotageAB公司通过直接销售部门及代理商已向全世界40多个国家提供了超过600套Pyrosequencing系统随着Pyrosequencing技术应用领域的不断拓展，近两年来，其市场也呈现快速增长的趋势作为一家高技术公司，强大的技术支持队伍是我们引以为傲的资源超过30％的职员从事客户与技术支持工作ANewLightonGeneticAnalysis一种全新的基于酶级联反应的新型遗传定量分析技术一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用……挑战你的极限想象力Pyrosequencing遗传分析技术PyrosequencingTMtechnologyPPiATPlighttime

C GTTCCACCT

相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解Pyrogram™Pyrosequencing焦磷酸测序技术的特点唯一得到定量序列结果的技术极高的准确性Built-InQC重现性极佳，接近100%通用型技术平台功能多样，应用领域极广可以用于任何遗传多态性的分析甲基化研究的最佳平台高通量、低成本,快速临床微生物诊断手段实验设计灵活自动化程度高，操作简单AseasyasPCR，asreliableassequencing强大的技术支持ESGCTAGTAGAGC/CESGCTAGTAGAGT/TESGCTAGTAGAGC/TWhatare”InbuiltControls”?SincePyrosequencingshowspolymorphismswithsequencecontext,youcanalwaystrustthevalidityofthedata.

1分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1分子的ATP，产生单位强度的光信号TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA...

Triple

DoubleSingleWhyPyrosequencingisquantitative？1.00.00.50.50.01.0Expected1.090.050.550.560.021.05Average0.02n.d.0.030.03n.d.0.03CVC/CC/GG/Gn=190Pyrosequencing：QuantitativeAccuracyTestPyrosequencing：facility&convenience实验设计方便，使用AssayDesignSW方便快速设计反应的最佳引物。实验快速，96个样本，SNP反应10分钟左右，SQA测序反应1小时左右，2分钟完成数据结果分析。实验准确性好，重复性高：准确性接近99％重复性接近100％高通量，一次可以完成96个不同样本的反应和分析。自动化程度高，准备好PCR单链后，反应和结果分析软件自动进行，利于标准化。操作简单，方便学习和使用。

AseasyasPCR，asreliableassequencingPyrosequencing的运用遗传变异方面WhatPyrosequencingcando

inGeneticVariationAnalysis

SNPAnalysis

InsertionandDeletion

MutationAnalysis

AlleleFrenquencyDetermination

CpGMethylationEstimationGeneCopyNumberTranscriptionEstimationPyrosequencingTM

技术运用于SNP与突变的研究SNPDiscoverySNPConfirmationAlleleFrequencySNPRelevanceSNPDiagnosticsVerifySNPastrueSNPFrequencyofSNPinpopulationsValidateSNPasmarkerforphenotypeUtilizationofSNPmarkers由于PyrosequencingTM技术可以通过光信号强度来定量，所以除了可以进行双等位点分析外，还可以用于三等位、四等位位点的分析，而且能准确判断纯合与杂合软件设计周到，具备强大的数据处理能力，可以通过一个反应来分析多个相邻位点准确性好，重现性高优势SNP位点在不同人群中的分布频率，是群体遗传学研究中的一项重要内容这些位点在正常人群与病人群体中的等位型的分布差异,更是流行病学、分子病理学乃至分子诊断的一项重要课题PyrosequencingTM

技术结合Pooling方法运用于等位频率分析准确灵敏：定量范围5%-95%甚至更高简便：反应结束后软件自动给出每个样品的等位频率,无需人工进行统计快速：只需其他方法十乃至千分之一的时间低耗：降低时间消耗的同时，成本百倍下降Pyrosequencing：AccurateQuantifyingRelativepeakheight==

peak1height

peak1height+peak2heightAllelefrequency==relativepeakheightx100(%)RelativepeakheightAllelefrequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%Pyrosequencing：

结合Pooling方法进行等位频率分析的技术60%10%90%5%0%75%50%25%Pooling方法的优势——省时、省力、省钱Theoreticalexample:Associationstudywith1000SNPsin1000healthyindividualsand1000patients

2000000analyses.Poolingstrategy:

1000SNPsin2samplepools1000X2=2000analyses2.DiscardSNPsthatarenotinformative(99%)3.Analyze1%(10SNPs)in2000individuals20000analysesIntotal:22000analyses

可以把分析SNP的原理同样运用于分析突变，插入／缺失PyrosequencingTM

技术运用于甲基化分析研究在许多基因promotor区域，有一种称为CpGIsland的结构，其序列的基本单元为CpG的二聚核苷酸。DNA甲基转移酶可以把S-adenosyl-methionine的甲基转移到CpG的C上基因的甲基化往往会引起相应的基因沉默。许多发育相关的基因，大多数情况下均处于甲基化状态，只有在发育的特殊阶段去甲基化表达。甲基化模式是可遗传的。甲基化研究对于了解基因的调控模式以及疾病的分子生物学机制具有重要意义：它与发育、肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活及许多遗传性疾病相关Methylation&DiseasesHowtoanalyzeCpGmethylation

2.PCR

amplificationTCmCU

1.BisulfitetreatmentofdenaturedDNAmCmCCU

3.Analysis:sequencing,MS-PCR,primerextension,restrictionenzymedigestion,hybridization…

orbestofall:Pyrosequencing!在重硫酸盐的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不发生转变。能够对每一个潜在甲基化位点的甲基化程度进行定量分析，无需烦琐的克隆以及大量的测序，基于序列这黄金标准，每个反应都有周边序列作为正负对照Built-inQC不但能帮助判断Pyro反应的准确性，更能判断前处理的完全与否。一个反应检测多个甲基化位点，使用最新的PyroQ-CpG软件可以在一个反应中对连续的20多个甲基化位点进行定量分析。无须重复试验结果准确Pyrosequencing在基因甲基化研究中的优势WhyPyrosequencing?

ConfidentlymeasuretheindividualdegreeofmethylationinadjacentCpGsitesinoneeasyanalysisPos1Pos2Pos3Pos4Pos5%methylationatindividualCpGsitesPos2Pos1Pos3Pos4Pos5Meanvalue6replicatesCV%60.1256.8566.8555.8763.152.92.62.71.72.9WhyPyrosequencing?Built-inQCthroughsequencecontextSequence:

C/TGGGGC/TGAGATTATC/TGTC/TGATAGC/TGGGGGWhyPyrosequencing?Nature-BornQCforcompletionofthebisulfitetreatmentBeforebisulfitetreatment:AfterbisulfitetreatmentandPCR:GCGGTCAGTGACGCGATGGAGCGGGCGYGGTTAGTGAYGYGATGGAGYGGGTAnyCnotfollowedbyaGgivesbisulfiteQCPyroQ-CpG软件专门用于甲基化研究的软件结合PyroGoldSQA试剂盒，可以对>100bp序列内的20多个甲基化位点进行定量分析。实验设计更方便，特别对多个连续的甲基化位点检测具体巨大优势。需要的PCR引物盒测序引物更少，更加节约试剂，降低实验成本。骨髓增生异常综合征髓系白血病

PyrosequencingTM

技术运用于临床辅助诊断Pyrosequencing：临床检验的未来载脂蛋白E（APOE）与脂类转运及脂蛋白代谢密切相关APOE的编码基因有3种最常见的等位基因型：e2，e3和e4三者之间的主要区别在于2个位点的多态性所导致APOE蛋白112位及158位氨基酸替换3种等位基因在不同的人群中有不同的分布

e3是在人群中分布最为普遍的e4

会提高总胆固醇浓度，增加晚发性家族型及散发性AD的发病风险，提早发病年龄；是胎儿期因碘缺乏引起的智力缺陷的风险因子；还与肾病及糖尿病的发病有关e2则能够降低总胆固醇及AD的发病几率，同时可能与长寿相关Pyrosequencing：临床检验的未来SPSNP112

SPSNP158FPRPB-----GGACGTG-----CCTGCACRCGCCGG----------TGCAGAA-----ACGTCTTCRCGGAC-----Pyrosequencing：临床检验的未来通过一个Duplex反应，对一段276bp的PCR产物内的这两个SNP位点同时进行分析，以确定受试者的apoe基因型，达到预警及辅助诊断的目的。Pyrosequencing：临床检验的未来e4/e4e2/e2e3/e4e2/e3Pyrosequencing：检测试剂盒Pyrosequencing：临床检验的未来

用Pyrosequencing技术分析RET基因Exon10、11、13、14、16中的共9个突变位点对217个MEN2阴性及230个MEN2阳性患者进行检测阴性符合率100%，阳性符合率99.6%Conclusion：Pyrosequencingtechnologyoffersanaccurate,nonisotopic,simple,andrapidmethodfortheanalysisofDNAfrompatientssuspectedofhavingMEN2.多发性内分泌腺瘤病

Pyrosequencing与HLA分型PyrosequencingTM

技术运用于药物基因组学研究DifferentallelesVariabilityinenzymeactivityIndividualizeddrugs/dose?PyrosequencingApplication：

CYP450Variation&PharmacogeneticsCYP是一个超基因家族目前已知的基因数目超过2400个所有基因均源于同一个ancestorgene(beforeeuc/procdiv.)其产物通常都包含一个Hemegroup,催化多种代谢反应CYP与绝大多数临床使用的药物的代谢均密切相关，尤其是CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19

Application：

CYP450Variation&PharmacogeneticsMajorallelescovered,moreinpipelineGCAC[A]GG....A2549del(allele3)TGC/TG....C2850T(allele2)ACA/CTCCGG…A2935C(allele7)ThereticaloutcomeNormalNormalHeterozygousallele3A/-Heterozygousallele2C/TApplication：

CYP2D6Multiplexassay(alleles2,3,7)CAG[T]GGGTG...T1707del(allele6)TCCG/TGT...G1758T(allele8)AG/AGACGCCC...G1846A(allele4)TheoreticaloutcomeNormalNormalHomozygousallele4A/AHeterozygousallele6T/-Application：

CYP2D6Multiplexassay(alleles4,6,8)TCCC/TGGG...G681A(allele2)ATC/TCAGGGGG...G636A(allele3)GCTTCAA/GTGG...A1G(allele4)Normal*1*2C/T*1*4G/ATheoreticaloutcomeforNormalApplication：

CYP2C19Multiplexassay(alleles2,3,4)基因印记与遗传性疾病西拉综合症，贝-威，普-威/安格尔曼综合症癌症基细胞及鳞状上皮细胞癌，腺瘤型息肉，乳癌，结肠/直肠癌，皮肤癌，白血病，前列腺癌，恶性黑色素瘤，纤维神经瘤，vulvarcancer，再生障碍性贫血，何杰金病，肺癌，宫颈癌，卵巢癌，子宫内膜癌心血管疾病，冠心病阿尔海默兹综合症自体免疫失调爱迪生氏病，即肾上腺性青铜性皮肤病，关节银屑病，系统性红斑狼疮，风湿性关节炎，重症肌无力

血液学血色素紊乱，血小板凝集增强，某些因子的缺陷，May-Hegglinanomaly（一种血小板减少性疾病）/Fechtnersyndrome，慢性骨髓性白血病，移植后的排斥

，HLA分型神经病学及神经病遗传学癫痫，肌强直性营养不良，多样性硬化，良性（家族）新生儿（初期）癫痫，脑梗塞，帕金森，神经管缺陷，肌萎缩性脊索侧索硬化，进行性核上眼神经麻痹症，神经退行性共济失调，精神分裂症，皮克症，孤独症频谱异常，惊恐障碍，痴呆症，忧郁症其它：WhatPyrosequencingcando

inGeneticVariationAnalysisMicrobiologyAnalysis

微生物分析

DNAsequencefromtheP3regionofthernpBgeneinStreptococcuspneumoniaePyrosequencing在微生物领域的应用细菌综合鉴定分型病毒的鉴定分型真菌的鉴定分型微生物抗药性分析ConventionalvsMolecularmethods传统方法——表型测试需要培养耗时长受环境的影响，变数多判断困难，有时需倚仗经验，有主观性有一些微生物培养上很复杂，难以鉴定分子方法无需培养快速准确即便是死样本也可以进行分型PyroMarkID：Approach确定研究对象及相关种群寻找特征⁄差异基因16SrRNA,18S,23SrnpBrpoBinlBAssayDesignSoftware：在目标基因的保守区设计PCR及测序引物焦磷酸法测定可变区序列IdentiFireSoftware：与数据库比对，确定分型结果WorkflowDNA制备样品收集/培养鉴定与分型结果PCR扩增单链模板制备Pyrosequencing数据库搜索/结果比对15min40min

1min/sample10min30min–2hrsAntibioticresistance

抗药性研究AntibioticresistanceinMycobacteriaRifampicin（利福平）——mutationsintherpoBgeneIsoniazide（异烟肼）——mutationsinthekatGgeneFluoroquinolones（对苯二酚）——gyrALinezolide(利奈唑胺

)resistancemutationsin23SEthambutol

（乙胺丁醇）——embBPyroMarkTMIDCompletesolutionforClinicalMicrobiologyPyrosequencing

系统平台AssayDesignSW

SamplePrep

PyrosequencingFeaturingPyroGoldchemistryIdentiFireTMSWPyrosequencing技术的流程PCR试样预处理，获得单链模板Pyrosequencing序列分析15min/96samperSQA:35min/96samperSNP:10min/96samper1-2h/96samper结果分析C/T

T/T实验设计PyrosequencingisworldwidelyusedGenomicsCollaborativeNIHUCDavisHarvardCenterforCancerPreventionYaleUniversityHowardUniversityHospitalforSickChildrenMaxPlanckInstituteBaylorCollegeofMedicineRIKENKarolinskaInstituteNCIGermanArmedForcesNASA

AstraZeneca

GlaxoSmithKlineMerckSchering-PloughAbbottJanssenPharmaceutica,NVBayerAG

Biogen

CuraGenCorporationDuPontAgriculture

LynxTherapeutics

Genzyme

第四军医大学全军基因诊断中心中科院健康中心上海仁济医院，上海肺科医院上海CDC，江苏省CDC

南京第二人民医院上海晶泰生物技术有限公司全球>600customers25accountswith2ormoresystemsPyrosequencingisworldwidelyusedThanksforYourAttention!PyroMarkPlatformInstrumentationReagentKitsVacuumprepworkstationIdentiFireSoftwareAssayDesignSoftwareSoftware实验流程单链的分离纯化Pyrosequ