人类线粒体DNA与疾病

人类线粒体DNA与疾病生物科学与技术学院朱敏

zhumin0678@2011-10-081人类具有两个基因组：核/染色体基因组（nucleicgenome)线粒体基因组(mitochondrialgenome)2线粒体（mitochondria）结构与功能↓线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）的遗传学特性↓mtDNA变异与疾病↓mtDNA变异与肿瘤↓mtDNA多态性与健康（如长寿）3

线粒体及线粒体DNA功能

线粒体是真核动物细胞（除成熟红细胞外）中唯一含有自己的基因组及遗传机制的细胞器，被称为细胞“动力工厂”，因为它通过内膜上分布的呼吸链(respirationchain)或称电子传递链(electrontransferchain,ETC)进行电子传递，完成对营养物质的氧化磷酸化(oxidativephosphorylation，OXPHOS)过程，最终产生ATP，供应细胞所需能量达95％。4

线粒体ETC被区分为五种复合物（complex)，均为多亚基蛋白复合体，大多由mtDNA和核基因产物共同组成。

5人mtDNA为16,569bp的闭环双链分子，一条为重链（H链），含较多鸟嘌呤，另一条为轻链（L链），含较多胞嘧啶。编码序列占绝大部分（～93％），编码为OXPHOS过程必需的13种多肽、2种rRNA及22种tRNA；mtDNA中不存在内含子，排列紧密。人类mtDNA序列于1981年由剑桥大学AndersonS等发表（Cambridgereferencesequences，CRS*)

*AndersonS,BankierAT,BarreiBG,etal.Sequenceandorganizationofthehumanmitochondrialgenome.Nature1981,290:457-465（rCRS序列登录号NC_012920）6人线粒体基因组结构和功能7

线粒体功能受核基因调节*ChabiB,AdhihettyPJ,LjubicicV,etal.Howismitochondrialbiogenesisaffectedinmitochondrialdisease?MedSciSportsExerc.,2005,37(12):2102-2110

8Bcl-2家族蛋白通过调控线粒体通透性及CytC的释放而调节凋亡9抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL位于线粒体双层膜外围并抑制细胞色素C释放。前凋亡型Bcl-2蛋白Bad、Bid、Bax及Bim位于胞质，但随死亡信号传递而转位至线粒体，促进细胞色素C释放：①Bad转位到线粒体并与Bcl-xL形成一前凋亡型复合蛋白。该转位行为为诱导Bad磷酸化的存活因子所抑制，导致其胞质滞留化。②胞质BID追随通过Fas途径的信号传递而被裂解，其活性片段tBid转位至线粒体。③Bax和Bim响应死亡刺激转位至线粒体。释放的细胞色素C结合Apaf1并与caspase9形成一活化型复合物。虽然调节凋亡期间线粒体通透性及细胞色素C释放的机制还未被完全了解，但Bcl-xL，Bcl-2和Bax明显影响着电势依赖性阴离子通道（thevoltage-dependentanionchannel，VDAC)，后者能调控细胞色素C的释放。10除了在细胞能量代谢和细胞凋亡中的核心角色外，线粒体及其遗传物质mtDNA也支持并参与多种其他细胞必需功能，包括中间代谢、内环境离子稳定、主动运输及脂质、氨基酸和核苷酸合成等11思考题1：线粒体主要执行哪些重要的细胞内功能？12由于mtDNA是线粒体执行其功能的必须结构基础，因此mtDNA变异参与构成与线粒体功能有关疾病的分子病因

。mtDNA与疾病13人类mtDNA的遗传学特性母系遗传：mtDNA呈母系单系遗传，子代mtDNA基本来自卵细胞。

男性也从母亲那里继承mtDNA，但却无法将它遗传给自己的后代。也就是说，如果一个女性生下的全都是儿子，那么她的“线粒体DNA”遗传链将因此终止。14

mtDNA平均数千-2万年发生一个变异，遗传时不发生重组，因此进化过程中所发生过的变异均能真实而连续地遗传下来，多个可遗传变异连锁形成不同人种群独有的mtDNA世系/单倍型(lineage/haplogroup)，即人类mtDNA具有种群系统发生特点。15CHerrnstadt,JLElson,EFahy,GPreston,DMTurnbull,CAnderson,SSGhosh,JMOlefsky,MFBeal,REDavis,andNHowellReduced-Median-NetworkAnalysisofCompleteMitochondrialDNACoding-RegionSequencesfortheMajorAfrican,Asian,andEuropeanHaplogroups2002,70(5):1152-11711.MitoKorMedicalCenter,SanDiego2.VeteransAdministrationMedicalCenter,SanDiego3.DepartmentofNeurology,UniversityofNewcastleuponTyne,NewcastleuponTyne4.DepartmentofNeurology,MassachusettsGeneralHospital,HarvardMedicalSchool,Boston5.DepartmentofRadiationOncology,UniversityofTexasMedicalBranch,Galveston

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线粒体Eve

1991年，有着五千年历史的“冰人奥茨”在奥地利蒂罗尔省冰山上被发现，牛津大学人类遗传学家布赖恩·西基斯首次提取并分析了这副古代骨骼的DNA，并通过DNA对比找到了“冰人奥茨”的一名直系后裔——居住在英国朴茨茅斯的一名妇女。21

欧洲人与夏娃的7个女儿西基斯通过长达10多年的寻找现代人类祖先的mtDNA比对研究发现97%的现代欧洲人都是“远亲”，都繁衍自10,000-45,000年前的7个不同女性，因为他们的mtDNA可区分为7种类型（即主要单体型）；同mtDNA类型的人是同一个女人的后代。这7名欧洲人“宗族母亲”是15-20万年前非洲大陆上一个被科学家命名为“线粒体夏娃”的女人的后代；全世界的人口分别繁衍自36个不同的“宗族母亲”。22

强者生存

古代欧洲并非只生活着这7个女人，但由于各种原因都没有遗传下自己的后代——“要么没有长到成年，要么没有生下孩子，要么生下的全是男孩，但这7个原始女人不仅活了足够长时间，并且每人至少生了两名女儿，从而展开其‘mtDNA’遗传链，并且一直延续至今。我想，只能用强者生存来解释这种现象。”“也偶尔发现有的人DNA不属于任何一个宗族母亲，他听了非常高兴，开玩笑说他可能是个外星人。”23Inthefieldofhumangenetics,MitochondrialEvereferstothematrilineal"MRCA"(mostrecentcommonancestor).Morereadat:/wiki/Mitochondrial_Eve2425近期本小组在湖南汉族人中发现了7种新mtDNA末梢分支单倍型（Genbank登录号：JF271009-JF271015）2627282.突变率高

mtDNA的组成特点：

缺乏组蛋白和非组蛋白缠绕；分子量小且缺乏内含子；随细胞分裂不断合成，但DNA聚合酶γ校对能力差，同时DNA损伤修复活性低下；由D环区单链启动复制，容易在tRNA基因部位出现发夹样结构29

mtDNA容易为各种伤害性刺激所损伤，其中主要包括线粒体内源性产生的能量代谢副产品-活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）。一般认为mtDNA的自发突变率远较核DNA高（约10-20倍）。30

高突变率的后效：不同人类群体之间及同一种群内不同个体之间mtDNA的高度多态性（可遗传变异）；同一个体不同组织细胞中随年龄老化和不同疾病状态的mtDNA散发性突变不断发生并累积（体细胞突变）。31与mtDNA变异相关的疾病被称为线粒体病（mitochondriopathy）。mtDNA变异与多种不同疾病包括AD、急性心肌梗死、双相精神障碍、拉贝氏遗传性视神经病、听力受损、PD、中风和Wolfram综合征（尿崩症，糖尿病，视神经萎缩和耳聋）相关联。3233“线粒体病”Leber氏遗传性视神经病(Leber’shereditaryopticneuropathy,LHON)

1988年Wallace等在LHON家系中鉴定出mtDNA11778G→A34线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(mitochondrialencephalopathywithlacticacidosisandstrokelikespells,MELAS)由位于mtDNA编码的tRNA之一UUR基因上3243G→A引发35线粒体耳聋mtDNA编码的12SrRNA基因上的T961C、C1494T和A1555G等被证实能够引发氨基糖苷类诱导性耳聋或非综合症耳聋。A3243G也能够导致母系遗传糖尿病伴耳聋综合征(MIDD)发生。36mtDNA多态性与复杂疾病心血管相关代谢性疾病

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease，AD)

帕金森氏病(Parkinson’Sdisease，PD)

肿瘤

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复杂性状疾病（complexdiseases）为两个或两个以上遗传基因与环境因素共同作用而引起的疾病，也称多基因病（polygenicdisease），包括先天畸形和人类常见病两大类。38易感基因（susceptibilitygene）被用来描述复杂性状疾病发生的风险（可能性）；多个易感基因联合发挥共显性效应而决定着个体对疾病的遗传易感性。根据相对风险贡献大小分为三大类：391）少数对表型影响较大的主基因（majorgene）；2）数量较多而对表型影响小的微效基因（minorgene）3）对主基因效应有微小促进或阻抑作用的修饰基因（modifinergene）。40

心血管相关代谢性疾病2004年：糖尿病并发症的4大分子途径及其最终所致并发症的氧化应激学说，再次掀起了糖尿病与线粒体相关研究的热潮。

*SloopKW,MichaelMD,etc.Hepaticandglucagon-likepeptide-1-mediatedreversalofdiabetesbyglucagonreceptorantisenseoligonucleotideinhibitors.JClinInvest.2004;113(11):1571-81.41阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)

AD是一种以进行性认知功能障碍和记忆损伤为主的神经退行性疾病。线粒体功能障碍在AD中占主导地位。将AD病人及正常人的线粒体分别注入人SH-SY5Y细胞（ρ0细胞）形成转线粒体细胞(cybrids)，结果ADcybrids细胞中ETC复合物IV的活性较正常对照下降52%。

42AD是两种因素交互作用的结果：线粒体功能受损导致ROS产出上升，发生增强的氧化应激反应，而氧应激又加剧对mtDNA及线粒体功能的损伤。43帕金森氏病（Parkinson’Sdisease，PD）

PD是常见的神经变性疾病，65岁以上的老年人患病率大约为1％，其病因尚未完全了解。Walt等：对609例PD白人患者和340例正常对照者的比较发现10398G对PD具有保护效应。

ChenCM等：70岁以上的台湾人中具有9055G—10398A—13708G单体型的老人对PD具有显著易感性。

mtSNP10398G使得电子传递链复合物Ⅰ中脱氢辅酶3(ND3)C末端苏氨酸→丙氨酸。44随着对mtDNA研究的不断拓展，发现早期所揭示的许多导致“线粒体病”的mtDNA突变实际上是某些特定单体型的特征遗传多态性*。这提示不同人群可能具有罹患特定疾病的不同风险。*QPKongetc.UpdatingtheEastAsianmtDNAPhylogeny:APrerequisitefortheIdentificationofPathogenicMutations.HumanmolecularGenetics,firstpublishedonline19May200645不同mtDNA变异对线粒体ETC活性即ATP和ROS的平衡产出具有微妙调节效应，而多重微小变化的加和可导致较重大影响，包括有些mtDNA变异可与其他mtDNA突变结合产生协同效应，以及还可能需要来自核基因的核-线粒体间相互作用。46

Howell博士称“线粒体序列变异已成为某些人类疾病的致病因子”，了解与线粒体内众多多态性相关联疾病的遗传学基础，将有助于确定特定疾病的高危人群，开展早期诊断和治疗；通过对大范围具临床特点的病人群体以及对照正常人群的mtDNA序列进行比较分析，希望有助于揭开mtDNA多态性与各种疾病之间的联系。47思考题2：与核基因相比，mtDNA具有哪些遗传学特点？

48mtDNA与肿瘤肿瘤是一种典型的复杂性状疾病，其发生发展涉及多基因改变。49肿瘤易感基因包括以下四大类：1）癌基因（oncogene）。2）抑癌基因（tumorsuppressorgene），又称肿瘤抑制基因或抗癌基因（antioncogene）。503）DNA损伤修复基因：它们组成人体DNA损伤修复系统。有些发生胚细胞突变，有些在人群中的分布呈多态性，这些遗传性变异直接造成个体DNA损伤修复能力和肿瘤发生的差异性；肿瘤患者的DNA损伤修复能力通常低于正常人群个体。

如BRCA1/2：乳腺癌风险相关基因514）代谢酶基因：在不同人种群及个体间呈现明显的多态性，代谢酶活性因而在不同个体间具有明显差异，导致对特异性化学致癌物代谢能力和由此所致肿瘤易感性差异。化学致癌物Ⅰ相代谢酶即细胞色素P450（cytochromeP450，CYP450s）系统是代谢活化致癌物的主要酶类。52机制研究：研究提示活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS)在肿瘤发生中起作用。ROS是正常线粒体ETC功能的副产品，如果因线粒体功能损伤、高脂饮食或内源性拮抗ROS活性低下导致在ROS产出与抗氧化能力之间失去平衡，则可能导致氧化应激压力增大。53体细胞mtDNA突变已在包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌、脑瘤及食管癌等在内的各种不同恶性肿瘤中被发现54

结肠癌

在对10个结肠癌细胞系的mtDNA突变研究中，Polyak等发现有7个存在突变，分别位于12SrRNA、16SrRNA、ND1、ND4L、ND5、cty-b和cyt-C氧化酶亚单位中。12种突变中11种是单碱基置换，一种为插入突变。

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胃癌

胃癌组织的D-loop区扩增显示18个基因位点的突变，其中有4种突变可能为D-loop区微卫星不稳定性所引起，因为较大比例的突变位于D310区。相对保守的12SrRNA区域同样发现了突变，尤其mt652G插入和mt716T—G易位。56

胰腺癌

Jones等在20种细胞系中检测到线粒体DNA突变主要位置为rRNA基因、复合物I的NADH脱氢酶基因(ND1~5)、复合物III的细胞色素C氧化还原酶基因(Cytb)、复合物IV的细胞色素C氧化酶基因(COXl~3)、复合物V的ATP合成酶基因(ATP6和ATP8)及D-loop控制区。57

卵巢癌

对原发性卵巢肿瘤的全线粒体基因组的测序发现有60％的癌组织存在突变，多为T→C或G→A转换，主要涉及4个区域：D-loop区、12SrRNA、16SrRNA和cytb编码区。58肿瘤中检测到大量mtDNA突变表明其与肿瘤发生相关

大量体细胞mtDNA突变为线粒体功能缺陷促进肿瘤发生和进展的学说提供了直接证据。但mtDNA突变与肿瘤相关性学说存在缺陷

突变难以获得重复检测；50％也见于正常个体或组织

-“副现象（epiphenomena）”论非中性进化（nonneutralevolutionofmtDNA）多态性变化连续群（continuum）中mtDNA错义（非同义）/同义取代率的上升，可能提示轻度有害性mtDNA变异体的出现。59肿瘤中mtDNA突变覆盖全部mtDNA功能区，而且190多种被报道的突变中实际上一半以上后来被证实为mtDNA遗传多态性。尽管现在还不清楚这些体细胞mtDNA突变为肿瘤起始的原因或是结果，但基于ROS的恶性循环，可以设想如果异变的mtDNA导致线粒体功能效率下降，即使变化甚小，ROS效应的积聚也可能随着时间推移增大了个体的肿瘤风险，即可以假设特定mtDNA遗传多态性独立或与mtDNA体细胞突变、或通过与核基因（或环境因素）相互作用而调节个体调节肿瘤风险。

60总体上，线粒体在能量代谢、ROS产出、凋亡启动及肿瘤生物学其他方面的重要作用凸显出线粒体功能在肿瘤形成过程中的重要性。低水平ROS调控细胞内信号途径并为正常细胞增殖所必需；癌细胞中ROS产出上升，引起氧化应激压力和DNA损伤，导致遗传不稳定性。因此，ROS被认为在肿瘤起始、进展和维持进程中具有多重作用。61mtDNA多态性与长寿mtDNA的某些多态类型可能与某种疾病的发生发展相关联，所以这些特定多态被认为是该疾病的高风险标志。例如mtDNA9055G、10398A和16519T等会显著增加乳腺癌的风险。同时这些位点上对应的置换性多态则可以看成是降低疾病风险的保护类型，如来自不同人种群的研究显示mtDNA10398G对人罹患PD有明显的保护效应。

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迄今为止调查研究显示，日本人平均寿命为全世界最高，而10398G多态性在日本人群中分布达到70％，且95岁以上的长寿人群中10398Ｇ型个体更占到80％，因此10398Ｇ型很可能是长寿的一个相关因子；相反，白种人作为帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的高发人群，则可能与10398A分布率高而10398G分布显著较低（约29％）有关。63

在我国，穆叶赛·尼加提等分析了10398A/G多态性与中国新疆维吾尔族长寿的关联性，将百岁组(≥100岁)65例、长寿组