遗传病的基因诊断

GenediagnosisBy黄春洪基因诊断G到T一个碱基的改变，决定了一个人的命运小皓珩出生23个月就出现皮疹、便血等病状，患上了罕见的原发性免疫缺陷病。DNA序列分析，证实了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突变为T，使编码谷氨酸的密码GAG突变为终止密码TAGWAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白，导致患儿血小板减少，淋巴细胞形态和功能异常希望：WAS目前已经可以用骨髓移植或干细胞移植根治Wiskott-Aldrich综合征（WAS）是一种罕见的血液病，以儿童为多见，重者多死于儿童期，呈X－连锁隐性遗传。临床上表现为血小板减少、湿疹和免疫缺陷三联征WASP基因包括12个外显子，基因组DNA长约9kb,其cDNA由1821个碱基组成，编码502个氨基酸残基的开放阅读框第一节概述一、

基因诊断概念

利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。传统的诊断１、问、望、听、触…—

经验型判断的方法。２、化验/检验——细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。３、影像学—X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。４、特殊检查—染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断

在第18届国际遗传学大会上，全世界3000名科学家对人类的生老病死做了新诠释——“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究病因”。除此之外，人类正常的发育、衰老和死亡，当然也受基因的调控。”基因诊断的特征：1不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3产前诊断避免患儿出生，提高人口质量我们先看一个短片

致

的舞蹈单基因遗传病：分类：常染色体隐性遗传病：常染色体显性遗传病：常染色体遗传病伴性遗传病多指、并指、软骨发育不全先天性聋哑、白化病、苯丙酮尿症伴X显性遗传病：伴X隐性遗传病：抗维生素D佝偻病红绿色盲、血友病、进行性肌营养不良基因疾病21三体综合征（先天性愚型）重型地贫:胎儿水肿综合征

早产死胎或出生前后死亡

可导致严重产科并发症

无理想治疗方法Pop-Question一个患抗维生素D佝偻病的男子与正常女子结婚，怀孕后，进行了遗传咨询，你认为正确的建议是（）A.只生女孩B.怀孕期多补钙C.不要生育D.只生男孩我国人口中有20%-25%的人患有各种遗传病！其中单基因遗传病约3%-5%，多基因遗传病约15%-20%，染色体异常遗传病约0.5%-1%。每年新出生的儿童中，有先天性缺陷的约1.3%，其中70%～80%是遗传因素所致。在自然流产儿中，约50%是染色体异常引起的！我国人口中患21三体综合症的人就在100万以上。统计资料遗传病的危害母亲生育年龄21三体综合征发病率<29岁1/1500030~34岁1/80035~39岁1/27040~44岁1/100>45岁1/50母亲生育年龄与21三体综合征发病率之间的关系中山大学达安基因诊断中心根据出生缺陷监测和残疾儿调查结果显示，我国是出生缺陷高发国家，每年有近100万出生缺陷儿发生，30％在出生前后死亡，40％造成终生残疾，只有30％可以治愈或纠正。在这些出生缺陷儿中，80%是由于遗传因素造成的。据监测数据显示：1997年—2008年北京市出生缺陷总发生率呈上升趋势，尤以2003年以后上升明显。1997年北京市出生缺陷总发生率为90.78/万，2001年为104.21/万，2007年为180.68/万，2008年为170.82/万。十年间，出生缺陷发生总率上升了一倍。基因诊断方法和传统的疾病诊断方法

表型诊断（传统方法）基因诊断（一）诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类临床诊断（病因、病解、病生）DNA诊断血清学诊断RNA诊断生化学诊断（三）特异性表型改变在很多情况下是非特以探测基因为目标，只要异性的，往往难以明确诊断，有特异性探针，利用分子延误病情?杂交原理即可诊断，具有很高的特异性。

（四）敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期诊断因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因难以早期诊断结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。（六）基因诊断范围广因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊断范围广。②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤疗效及预后尤为重要。③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。（七）二者关系

1.基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）

2.基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。

3.尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）

4.同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云。基因诊断的应用范围1.检测病原微生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.诊断先天遗传性疾患，产前诊断－优生学3.检测后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。4.其他如亲子鉴定、个体识别、法医物证。爸妈谁要我？遗传病基因诊断的现状

人类已知的单基因遗传(包括基因和异常表型位点)总数超过

1万4千种,都列入OMIM(/OMIM)我国各种先天性缺陷和遗传性疾病约占5%

美国目前就有100多个遗传病分子诊断实验室开展300多种基因病的分子诊断。所有实验室均需标准化(实验室认证,人员资格认证)国外遗传病检测的项目

常染色体显性遗传病诊断性遗传检测基因软骨发育不全症FGFR3Marfan综合征FBN1Charcot-Marie-Tooth神经病

PMP22,EGR2,MPZ,NEFL,MTMR2

先天性心脏病(LQTS),各型

KCNQ1,KCNH2,SCN5A,KCNE1神经纤维瘤(1型,2型)NF1,NF2多囊肾(1型,2型)PKD1,PKD2结节性硬化(1型,2型)TSC1,TSC2遗传性高胆固醇血症LDLR

染色体隐性遗传病诊断性遗传检测基因囊性纤维化症CFTR先天性神经性耳聋(SNHL),

GJB2,GJB3,SLC26A4先天性心脏病(LQTS)

KCNQ1,KCNE1地中海贫血症,B型HBB(血红蛋白B链)白化症OCA1苯丙酮尿症

PAH脊柱肌萎缩症

SMN1肝豆状核变性(Wilson)病

ATP7B多囊肾PKHD1,PKHDL1

先天性代谢病

X-连锁隐性遗传病诊断性遗传检测基因杜兴肌营养不良症DMDRett综合征MECP2血友病(A型,B型)

F8,F9白化症OA1G-6-PD缺乏症G6PDX-连锁显性遗传病遗传性肾病(Alportsyndrome)COL4A5

Y-连锁遗传病性反转病SRYSOX9无精症或少精症DAZ

基因诊断方式间接诊断（诊断与致病基因连锁的基因）直接诊断（直接诊断致病基因）一、疾病相关遗传标志的连锁分析

（间接诊断）

适用于连锁分析的遗传标志应具备三个特点：不同个体间存在多态性；2.有足够的家系成员样本以确定标志基因与致病基因间的连锁关系；3.紧密连锁，排除减数分裂中出现重组的可能。此外，标记基因的数量要足够多，最好能高密度遍布整个基因组。遗传标志：第一代RFLP标志（限制性片段长度多态性）第二代微卫星标志（短串联重复序列）第三代SNP标志（单碱基多态性）疾病基因定位和克隆利用连锁分析或关联分析找出疾病基因在染色体基因组上的位置。用现有的能覆盖全基因组的多态性标记（STR,SNP)，进行全基因组扫描，发现与疾病基因连锁或关联的遗传标记，就可以大致确定疾病基因的定位。疾病基因遗传标记1遗传标记2遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记位置已知，就可确定疾病基因的位置。遗传标记1、2与疾病基因连锁或关联。其它不连锁。1.RFLP(限制性酶切长度多态）

Restrictionfragmentlengthpolymorphism基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。-GAATTC-GAATTT-GAATTC-CTTAAG-CTTAAA-CTTAAG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAGAATTC-GAATTT-GG-CTTAAA-CTTAAAATTC-GG-CTTAAEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIRFLP分析法

镰状细胞贫血的基因诊断限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了MstⅡ的位点，便形成1.3kb珠蛋白的DNA片段。×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析遵循孟德尔式遗传Gene异常不明确的遗传病的诊断•例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。•APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。2、短串联重复序列(shorttendemrepeats,STRs）或微卫星（mini-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是2bp-8bp的串联重复，重复次数n=15-60，已知8000多个，主要形式为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n为多见。约30－60kb就存在一个STR，不同个体STR拷贝数相差悬殊，导致其形成高度的遗传多态性。除了同卵双生子，个体间STR均不同。

1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。个体间STR拷贝数变异不改变STR及两翼的碱基组成，所以只要核心序列一致，就可以利用限制性内切酶进行剪切，形成不同长度的片段。因此也可以利用Southern杂交作图。DNA指纹（DNAfigerprinting):法医上亲子鉴定，刑侦。唐氏综合征（21三体）基因诊断

选择21号染色体上的D21S1414、D21S1413、D21S1432、D21S1437、D21S1446、D21S2054,6个高杂合度的STR基因座扩增。（3）单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）定义：不同个体间，基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。为基因组变异中最多的一种,在DNA多态性中占90%，其最低的等位基因频率需大于或等于1％。1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。第三代遗传标记—单核苷酸多态性(SNP)

某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体A个体B个体C

SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90%。单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP对于人类来说，SNP的意义在于：１、致病SNP２、疾病易感性SNP３、具有诊断价值的SNP４、疾病的SNP谱５、人表型相关SNP６、药物作用与不良反应的SNP７、药物剂量SNP目前SNP研究的两个热点：１、cDNA上的SNP（cSNP）２、启动子上的SNP芯片杂交结果示意图ACGT位点1位点2位点3常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。DNA测序SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP的实质是碱基的替换，且大多为转换，转换与颠换之比为2︰1。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶（C→

T）。

二、对疾病致病基因结构异常的直接诊断针对基因突变谱已清楚的遗传性疾病优点：1、不需依赖家系调查2、简单、准确（一）基因缺失或插入的诊断（二）点突变的诊断（三）STR序列的诊断（一）基因缺失或插入的诊断1、Southern印迹Southern印迹一般可显示50bp-20kbDNA片断，片断大小的信息是该技术诊断基因缺陷的重要依据。基因探针的定义：

基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。探针的标记：放射性同位素标记（32P、35S）、地辛高、辣根过氧化物酶、生物素。方法：缺口平移、六核苷酸引物标记法。基因探针的标记：1、缺口平移法（NickTranslation）反应体系中DNA酶随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。NickTranslationDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶IOHpOH+PP32P-dNTPBio-dNTP2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）

利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’→5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复性Southern印迹杂交-+样本抽提HindⅢ消化，琼脂糖凝胶电泳将凝胶放入碱性溶液中，使DNA变性杂交洗膜放射自显影大小分子量HindⅢHindⅢ缺失探针设计探针标记探针ABCABC

Southern杂交法实验结果可靠，但操作繁琐，费时费力，又要使用放射性同位素，因而难以广泛开展。2、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）原理：1）引物的设计：合成2个与目的DNA序列两侧互补的寡核苷酸，一般长约15-25bp。引物的序列决定扩增片段的长度；

2）基本条件：引物、DNA模板，dNTP，

TaqDNA聚合酶，buffer3）反应程序：变性：93-95；复性：50-70

延伸：70-75。n个周期，2n个DNAPCRPCR扩增预变性(93-95C,2-5m)变性(93-95C,30s)复性(50-70C,30s)延伸

(75C,30-60s)总延伸

(75C,5m)(25-35)PCR的一般过程：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。PCR特点及应用：特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快速；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断;缺点：（1）需靶DNA序列的信息；（2）产物短小，DNA复制不精确。PCR相关技术：1.增效PCR（boosterPCR）

当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。2.巢式PCR（nestPCR）也是二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3、多重PCR

1.DNAMarker2.阳性对照

3.孕妇

1.DNAMarker2.阳性对照

3.孕妇4.胎儿

5.阴性对照

4.胎儿

5.阴性对照采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇1.DNAMarker2.阳性对照3.孕妇4.胎儿5.阴性对照4.胎儿5.阴性对照采用多重PCR法扩增该基因的多个外显子4.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。RT-PCR5、单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）

是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA

电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行

PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA

构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。PCR-SSCP过程：

primer

↓32P-dNTP掺入

PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345

自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者

3.为杂合子

.

解链构象DNA原理过程（二）点突变的诊断1、ASO杂交2、反向点杂交3、DNA芯片技术4、变性高效液相色谱1.等位基因特异寡核苷酸分子

(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成ASO用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种是野生型探针，与无突变序列互补杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种是突变型探针，只与突变基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.-GCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGA--CGGGACACCCCGTTCCACTTGCACCT--GCCCTGTGGGGCTAGGTGAACGTGGA--CGGGACACCCCGATCCACTTGCACCT-GTGGGGCAAGGTGAACGTGGGGCTAGGTGAAC正常探针检测孔突变探针检测孔正常突变基因组

DNAβ地中海贫血CD17点突变的ASO分子杂交ABCA：正常人只与正常ASO探针杂交B：突变人只与突变ASO探针杂交C：杂合子与两种ASO探针都杂交2、反向点杂交（reversedotblot,RDB）

反向点杂交（RDB）检测点突变的原理和ASO法相同，但RDB是在膜上固定ASO探针而非固定靶DNA。为了同时检测多种突变，可以将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上。这样，在一个杂交反应中便能同时分析一个标本中可有存在的多种点突变，大大提高了基因诊断效率。

基因芯片是信息时代的产物90年代兴起的一项前沿生物技术横跨：生命科学、物理学、计算机科学、微电子技术光电技术、材料科学等现代高科技3、DNA芯片技术1）什么是基因芯片（Genechip）

所谓基因芯片是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，得出样品的遗传信息（基因序列和表达信息）基因芯片杂交结果图基因芯片扫描结果

不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫2）基因芯片的工作原理标记的待测分子与被固定的探针杂交。3）基因芯片的特点：探针数量多密度高，所以一次可以对大量的DNA分子或RNA分子进行检测分析。常用支持物常：玻璃片，聚丙烯酰胺板、金属片、硅片等，玻璃是最常用的材料。常用的待测分子PCR产物：序列分析RT-PCR产物：基因表达分析基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析1）提取患者基因组DNA2）DNA样品PCR扩增并进行标记。GenomicDNA4）生物芯片的优点（1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。节省时间。（2）微型化，实验所需试剂用量少（3）高度自动化5）缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。基因芯片的应用基因芯片具有巨大的应用前景1.基因功能分析研究2.检测与疾病相关的基因,

进而用于疾病诊断3.药物筛选4.用于组织配型5.其他基因功能分析研究

将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。1）肿瘤的基因诊断

例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。2）用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片3）用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。疾病诊断12月1日是世界艾滋病日，近期艾滋病现状及科研进展也成为众人瞩目的焦点。来自新华网的消息，“严重传染病诊断基因芯片的开发研究”项目在云南省通过三年的实施，目前在乙肝病毒（ＨＢＶ）、丙肝病毒（ＨＣＶ）、艾滋病病毒（ＨＩＶ）的基因芯片联合诊断技术研究方面取得突破性进展。用基因芯片技术对ＨＩＶ等传染病病毒进行检测时，１毫升的血液中只要含有１００个病毒颗粒即可得出结论，而此前的检测方法要等到血液中病毒颗粒达到１万甚至１０万才能奏效。例：上海复旦长将生物医药股份有限公司开发了HLA分型芯片，目前已在国内各大血站投入应用。用于组织配型（三）STR序列的诊断STR扩增的遗传性疾病，可采用PCR直接扩增技术来诊断。方法：以致病靶位点的STR及其周围序列为模板，设计合成一对STR两侧翼的寡核苷酸引物，样品经PCR扩增后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可直接检测扩增片断的长度，计算出STR的串联重复拷贝数。脆性X综合症一种X连锁智力低下疾病。以男性患者显著，并伴有其他行为异常。FMR1是脆性X综合症相关基因。在FMR1基因5’-非翻译区存在(CGG)n的多态性。正常：n介于7-50之间，平均为30。前突变：n介于50-200之间，基因转录和蛋白水平相对正常，但是不稳定，到下一代可能发展成全突变的几率成指数增加。全突变：n在200以上，基因失活而发病。CGGCGG正常引物1引物2引物1CGGCGG前突变引物1引物2CGGCGG全突变引物1引物2引物1M1231、正常2、前突变3、全突变PCR扩增后电泳第三节基因诊断的应用一、辅助遗传病的临床诊断二、疾病易感性及患病风险预测三、疗效评价及用药指导四、其他应用著名基因诊断机构GENETests()二、疾病易感性及患病风险预测

（一）遗传病患病风险分析

1、出生缺陷的产前诊断2、植入前遗传诊断3、遗传筛查植入前遗传诊断

植入前遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）是指对移入宫腔之前的胚胎进行快速的遗传学诊断，筛选出健康的胚胎，以避免缺陷患儿的出生。

主要利用微操作技术和DNA扩增技术对胚泡植入前进行检测。

植入前诊断的介入时间通常是受精卵分裂到4～8个细胞期时，用显微操作仪吸取1～2个卵裂球细胞经FISH或PCR进行快速的遗传学诊断。

FISH：荧光原位杂交（二）其他疾病易感性预测性诊断1、肿瘤检测癌基因及抑癌基因（ras家族、C-myc、C-erbB2、EGF、TGF-α、P53、MTS1等）

①视网膜母细胞瘤与Rb基因②肾母细胞瘤与WT1基因③家族性结肠癌与APC基因④乳腺癌与BRCA-1基因：BRCA-1是重要的抑癌基因，该基因突变导致约45％遗传性乳腺癌。⑤肺癌K－ras基因15－50％⑥宫颈癌：高危人乳头瘤病毒（HPV）

肿瘤的基因诊断策略一：易位染色体和融合基因检测

如T细胞受体基因TCR与IgH重排后，原先间隔数百bp的V区和J区靠近，通过扩增片段长度判断是否重排策略二：癌基因和抑癌基因检测

如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密码子130～290之间的基因突变肿瘤基因诊断策略三：病毒癌基因检测

多种DNA或RNA病毒感染与肿瘤相关策略四：肿瘤标志物检测tumormarker:肿瘤组织产生的、与肿瘤发生发展相关的物质，如肿瘤抗原、激素、酶等。三、疗效评价及用药指导1、临床上检测微小残留病：

FISH检测或PCR直接扩增2、避免药物的不良反应：氨基糖甙类抗生素致聋的病因学与线粒体DNA12SrRNA基因第1555位A→G均质性点突变有关。荧光原位杂交FISH四、其他应用（一）法医学个体认定DNA指纹分析（DNAfingerprinting）

选择若干个基因位点（如STR、HLA位点等）设计相应的PCR引物对，对待测DNA样本进行PCR扩增，带型比较后即可判断结果。（二）病原体诊断抓狂的护士母亲父亲ABCDDNA指纹分析用于个体鉴定第三节基因诊断的应用一、遗传病的基因诊断（一）血红蛋白病血红蛋白病是由于血红蛋白合成异常所致的遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血２类。

1.异常血红蛋白病是珠蛋白肽链结构的改变变导致主要功能部位氨基酸的置换，影响Hb的溶解度、稳定性及生物学功能。分子基础：单碱基替代，缺失、插入……

２.地中海贫血（α地中海贫血和β地中海贫血）是珠蛋白合成速率降低，导致链和非链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在Rbc膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。4.诊断要求HbPunjabα地中海贫血（α珠蛋白合成↓）β地中海贫血（β珠蛋白合成↓）占我国新疆异常Hb病55.6%（1）产前诊断为主要目的。每一民族或群体有特突变类型谱中国人主要突变类型有6种（P30）分子基础Hbβ链121密码单个碱基替代：GAA（Glu)→CAA（Gln）→改变了EccRI一个识别位点大多数是α珠蛋白基因缺失所致。点突变、缺失或插入往往不涉及限制酶识别位点。DNA诊断：PCR扩增（β珠蛋白第3个外显子和基因3´端DNA序列、全长144bp）EcoRI酶切电泳分析。（3）液体分子杂交C1限制酶谱分析，或PCR扩增电泳分析PCR/ASO探针法（主要方法）结果正常对照40/104bp两个片段HbPuNJob144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增β珠蛋白DNA片段MnlI酶谱分析诊断HbE（β26Glu→Lys))正常对照有正常杂交信号（C1）酶切片段不缺（C2）PCR产物有（C3）α地贫与正常结果反之。PCR/RFLP连锁分析法RNA诊断：异常Hb病人mRNA的RT/PCR产物测序知编码区碱基变化—推导相应氨基酸变化。RT-PCR介导的α珠蛋白mRNA定量↓。①PCR介导的mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷检测（自学）（二）杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（BMD）

1.DMD和BMD是常见的性连锁隐性遗传病，

2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。

DMD多在5岁发病，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。

BMD症状较DMD为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为1/30000。

3.分子基础：抗肌萎缩蛋白基因内（1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。（2）部分重复（病例的5%）（3）缺失或重复的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。4.DMD、DNA诊断因DMD（及BMD）大多数为基因缺失所致，该病DNA诊断主要是抗肌萎蛋白基因缺失的检测。诊断技术：（1）基因组探针法用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来接进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2）cDNA探针法抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。（3）多重PCR法如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多态性分析法基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析或CA多态性分析适用于非缺失型DMD。5.DMD、RNA诊断：诊断技术RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。（三）苯酮尿症（PKU）

1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。

2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。

3、分子基础：（1）迄今约3/4的导致中国人经典型重PKU的突基因已被查清，它们分属11种基因PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。（2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性，故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。苯丙氨酸羟化酶↓（肝、PAH）4、DNA诊断：①PCR/ASO探针法。若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。②PCR/SSCP—直接则序法→不定期出导PKU的点突变。5、序列多态性连锁分析前提是该家系存在述第399密码子序列多态性用于产前诊断：（不知基因实变类型，也无RFLP信息。）病案—某孕妇曾生育一例PKU患者，现妊娠第二胎8周，要求对胎儿进行产前诊断。诊断：（1）PAH基因的RFLP分析：该家庭除ECORI外，其它酶切点都不具有杂合性，而丈夫、患儿、孕妇、胎儿双均为ECORI11/17kb片段的杂合子，因此胎儿可能正常，可能为PKU患者。据RFLP分析无法对胎儿作出产前诊断（为什么？缺乏基因连锁分析先决条件。（2）序列多态性：PCR/ASO探针DNA片段点杂交法。①PCR扩增父亲、孕妇/患儿、胎儿PAH基因片段。②合成ASO（相应于第399密码子中性实变序列的一对等位基因的特异ASO探针。③杂交：说明：①患儿扩增DNA片段与正常/中性突变ASO探针杂交;②父亲;③胎儿扩增a、患儿的1个PKU，基因与密码子399A→T中性突变相偶（连锁），这个PKU基因来自母方。a.孕妇。b、胎儿没有这一中性实变，可以排除胎儿为PKLL患者，结合ECLRI位点RFLP资料，可产和的诊断胎儿完全正常。c、胎儿出生后基因分析和随方证实诊断正确。DNA片段中能与正常的ASO探针杂交。四、血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。

主要特征：①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。②缺乏Xq远端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突变具极为异质性，与β地贫不同。（因子占X染色体全长0,1%，共186kb包括26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析）①也是X连锁遗传的凝血缺陷疾病。②约1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代疗法过程中会产生FIX的抑制物）。③在非缺失（FIX基因）型中，已发现398种不同的基因突变。（FIX基因定位在Xq26→q27，全长34kb包括8个外显子）。①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鉴定了FIX基因的5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊断和携带者检测。②病倒：乙型血友家系分析FIX基因发现某患者缺失该基因5kbDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子）a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊断，诊断胎儿为男性乙型血友病患者。b、对该孕妇第二胎产前诊断为女性乙型血友病基因携带者。（上海医遗传所淅江乙型血友病家系）4、诊断情况（报道）：①应用克隆化FⅧcDNA与VIII基因连锁DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁侧的限制酶酶切位点多态性，并采用PCR/BCLI或XbaIRFLP连锁分析法进行了甲型血友病的产前诊断和携带者检测。②用PCR/SSCP法检查了FVIII内含子18处BCLI的多态性。（终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证实产前诊断正确。）类别基因特征诊断方法1、病毒性肝炎①甲型肝炎（HAV）①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。②已获HAV几个毒株cDNA克隆。①CDNA探针杂交（RNA）法。②SSRNA探针杂交（RNA）法有报道。②乙型肝炎（HBV）①HBVDNA约3.3kb，是非共价闭合的环状结构。①PCR斑点杂交法。②PCR电泳EB染色法③丁型肝炎（HDV①HDV基因为环状SSRNA长约1678个核苷酸①DNA或cDNA探针杂交（RNA）法②RT/PCR单抗ELISA法2、细菌引起的疾病（1）产毒性Ecoli、侵袭性Ecoli;(2)霍乱弧菌；（3）痢蒺杆菌；（4）淋球菌基因诊断用PCR扩增斑点杂交法。3、疟疾、寄生虫基因诊断用PCR或结合探针技术。二、传染病的基因诊断谢谢自测题一、单项选择题1、1976年简悦威采用液相DNA分子杂交技术在世界上首次完成了（）A、α－地中海贫血的基困诊断

B、β－地中海贫血的基困诊断C、血红蛋白病M的基因诊断D、疟原虫的基因诊断2、基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括（）A、血清学诊断B、生化学诊断C、产前诊断

D、病理学诊断3、在核酸分子杂交的基因分析方法中，最经典的是（）A、NorthernblotBWesternblotCdotblotD.Southernblot4、聚合酶链式反应（PCR）又称为基因体外扩增，它与基因体内扩增不同的是（）A、反应体系模板不同B、聚合酶辅基不同C、聚合反应方向不同D、反应体系所需温度差异5、检测长度相同而构象不同的单链DNA需要进行（）A、琼脂糖凝胶电泳B、聚丙烯酰胺凝胶电泳C、琼脂粉电泳D、圆盘电泳6、限制酶酶谱分析中，常用的限制酶是指（）A、Ⅰ型限制酶B、Ⅱ型限制酶

C、Ⅲ型限制酶D、Ⅰ型和Ⅲ型限制酶7、限制酶酶切图谱经常被人们称作（）A、DNA的遗传图谱B、DNA的连锁图谱C、DAN的消化图谱D、DNA的物理图谱8、核酸序列测定方法始建立于（）A、20世纪50年代初期B、20世纪60年代初期C、20世纪70年代后期

D、20世纪80年代后期9、Sanger双脱氧末端终止测序法的链终止剂是（）A．2、3－二脱氧核糖核苷酸B、2、4－二脱氧核糖核苷酸C、3、4－二脱氧核糖核苷酸D、3、5－二脱氧核糖核苷酸10、20世纪90所代初，适应“后基因组时代”的到来，基因芯片技术率先（）A、在美国启动

B、在日本启动C、在欧洲启动D、在以色列启动11、基因芯片的实质是一种（）A、高密度的单克隆抗体列阵B、高密度的多肽列阵C、高密度的核酸列阵

D、高密度寡核苷酸列阵12、对于突变位点已被阐明的一些遗传病，可以采用基因诊断的方法是（）A、PCR/ASO探针法

B、PCR/SSCP/sequencing法C、RT/PCR法D、RFLP分析法13.α-珠蛋白质基因蔟定位于（）A、6P13.3-Pter，B、17P13.3-Pter，C、18P13.3-Pter，D、19P13.3-Pter，14、α-地中海贫血患者的分子缺陷主要有（）A、2种基因型B、3种基因型

C、4种基因型D、5种基因型15、地中海贫血是一种（）A、巨幼红细胞贫血；B、营养性缺铁性贫血；C、遗传性溶血性贫血；

D、障碍性贫血16、B-地中海贫血患者的基因缺陷主要有（）A、少数核苷酸的缺失或插入；B、大片段丢失或插入；C、基因重排或染色体易位；D、点突变或阅读框易位

17、杜氏肌营养不良症（DMD）患者基因缺失的主要热点区位于DMD基因的（）A、起始区；B、尾区；C、中央部位；D、中央部位的内含子区域18、甲型血友病的基因缺陷是（）A、

凝血因子Ⅷ片段缺失，点突变或插入；B、

凝血因子Ⅸ片段缺失，点突变或插入；C、

PAH的严重缺乏；D、CK的水平升高19、用基因诊断的方法对感染性疾病进行诊断的主要优点是：A、

诊断过程对人体没有损伤；B、可以进行病因诊断；C、方法简便，费用较低；D、可以早期诊断20、目前普遍采用SOUTHERN印迹杂交进行DNA指纹分析，用于法医案检工作中的个体识别和亲子鉴定，其分子基础是（）A、

DNA的多态性；

B、RNA的多态性；C、蛋白质的多态性；D、氨基酸的多态性二、多项选择题1、人类疾病的发生常常涉及到（）A、

内源基因的突变；B、外源基因的入侵；C、基因重组；D、姐妹染色体交换2、机体对外源性病原体入侵的防御体现在（）A、整体水平；B、细胞水平；C、分子水平；D、基因水平3、基因诊断的目的是为了（）A、

确诊相应的疾病；B、得出相应的结论C、作为防治疾病的依据D、开展基因治疗4、从基因诊断的发展史来看，具有代表性的分子生物学技术有（）A、核酸分子杂交；B、PCR；C、DNA芯片技术；

D、限制性酶切图谱分析技术5、基因诊断的技术和方法按原理大致可分为（）A、DNA探针技术；B、PCR技术C、DNA探针和PCR结合的技术

D、DNA测序技术6、基因诊断的途径有：A、直接探测基因结构是否存在突变；B、检测基因转录产物mRNA是否表达异常；C、检测基因表达产物蛋白质结构的变化；D、根据临床诊断的初步结论进行基因诊断7、对感染性疾病进行基因诊断的分子生物学依据是：A、DNA或者RNA是生物遗传信息的载体；B、所有生物使用相同的构件分子；C、每种生物大分子在细胞中有特定功能D、每个物种的特性是通过它具有的一套与众不同的核酸和蛋白质而保持的8、基因突变存在以下共同特点，即（）A、稀有性B、随机性C、可逆性D、有害性9、目前常用的基因探针有（）A、cDNA探针B、基因组探针C、人工合成DNA探针D、RNA探针10、常用的基因探针标记的方法有（）A、地戈辛标记B、生物素标记C、放射性P标记D、放射性35S标记三、名词解释1、基因诊断2、

DNA指纹3、RFLP四、答题1、简述你对基因诊断的概念的理解2、简述基因诊断的基本途径3、简述基因诊断的基本技术和方法4、简述基因指纹在法医案检工作中个体识别与亲自鉴定的分子生物学基础五、

论述题1、试论基因诊断方法与传统疾病诊断方法的区别与联系？2、论基因诊断与医学诊断学的辨证关系3、试论遗传性疾病基因诊断的思维