肠道病毒71型灭活疫苗

Enterovirustype71inactivatedvaccine课程：生物技术制药班级：2013生技一班肠道病毒71型灭活疫苗刘雨桐EV71图片肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)为单股正链ＲNA病毒，是小ＲNA病毒科肠道病毒属中的重要成员之一。EV71基因组由7400多个核苷酸构成，包含一个开放读码框，编码大约2200个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可被进一步水解成P1、P2和P3三个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白，P2、P3前体蛋白编码7种非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)

EV71包括A、B和C3种基因型，11个基因亚型，每种亚型感染均可引起手足口病(hand，footandmouthdisease，HFMDEV71简介0102020203人血浆中含有的中和抗体可在细胞基质上中和不同的EV71。可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病及死亡现象，而在毒株攻击乳鼠的同时或其后限定的时间内注射含EV71中和抗体的人血浆，可起到保护乳鼠的作用EV71感染或疫苗免疫动物后产生的抗体具有病毒中和活性；中和抗体在体外与EV71中和后，可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病性；EV71疫苗除能诱导中和抗体外，还能诱导细胞免疫应答，其也具有免疫保护作用。EV71疫苗可行性01020304全病毒灭活疫苗

减毒活疫苗

基因工程疫苗

病毒样颗粒(VLPs)疫苗

肠道病毒71型疫苗分类05合成肽疫苗

为什么选择灭活疫苗生产工艺成熟，具有良好的免疫原性及安全性，众多研究证明灭活EV71病毒疫苗较其他形式疫苗，如VP1亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗有更好的免疫效果，是EV71疫苗发展的主要类型。目前进入临床研究的5株EV71疫苗均为灭活疫苗，而临床试验结果表明这些疫苗均有较好的免疫原性及安全性。（2014）

在中国内地1998年后流行株均为C4，故中国企业研发的疫苗均以

C4型毒株作为疫苗株。12二倍体细胞疫苗生产工艺：ＥＶ７１疫苗株ＦＹ－２３Ｋ－Ｂ株在人二倍体细胞（ＫＭＢ１７株）上适应传代，收获病毒液，经灭活、浓缩、层析过滤，吸附氢氧化铝佐剂后，制备成为肠道病毒７１型灭活疫苗成品。Ｖｅｒｏ细胞疫苗生产工艺：疫苗株ＥＶ７１ＡＨ－ＦＹ７ＶＰ５株或Ｈ０７株感染Ｖｅｒｏ细胞后，收获病毒培养液，经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析纯化、甲醛灭活，吸附氢氧化铝佐剂后，制备ＥＶ7１灭活疫苗成品。

ＥＶ７１灭活疫苗两种类型01

ＥＶ７１病毒液的培养

及灭活02EV71病毒的纯化、检测及制备03ＥＶ７１灭活疫苗免疫原性检测及保护性研究ＥＶ７１灭活疫苗制备一般流程12病毒液的灭活收获病毒液按１∶４０００（Ｖ／Ｖ）加入福尔马林，３７℃灭活，并每间隔2ｈ取样，采用微量滴定法进行感染性滴度检测以观察其灭活效果。

病毒微量滴定法：将灭活后的病毒液按１０倍梯度稀释，以１００μｌ／孔置于９６孔平底细胞培养板，每个稀释度接种８孔，每孔按１×１０４细胞／１００μｌ培养液加入Ｖｅｒｏ细胞，３、７ｄ时观察记录病变，超过５０％细胞病变孔判为病变阳性ＥＶ７１病毒液的灭活EV71病毒的纯化、检测及制备ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＨＰＬＣ检测将纯化后的产品进行灭活疫苗成品的制备0102030401020304膜分离技术

超速离心

凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography，GF）

离子交换层析（ion-exchangechromatography，IEC）

肠道病毒71型灭活疫苗分离纯化方法05疏水相互作用层析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

03Options02Options01Options疫苗标准方面国家质量控制和审评部门结合2010版《中华人民共和国药典》和修订企业注册标准中对预防性疫苗的要求，对申报临床试验的灭活疫苗毒株、原液和成品标准进行规范和统一。对种子库要求疫苗主要保护区ＶＰ１氨基酸序列在三级种子批均保持一致；疫苗纯度控制方面在疫苗纯度控制上，

高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）规定颗粒峰面积不低于９５．０％，疫苗动物效力统一修定为以１针后半数有效量（ＥＤ５０）作为效力指标，保证了疫苗生产的一致性和有效性；标准品方面中国食品药品检定研究院（中检院）联合３家企业已完成了疫苗中和抗体检测标准品和疫苗抗原定量标准品的研制（２０１０国生标字００２３、００２４）。正在开展的疫苗标准研究包括：比活一致性标准，Ｖｅｒｏ细胞残余ＤNＡ标准等；开展的疫苗标准品研究包括疫苗效力标准品和冻干标准中和抗体检测株等目前，亚洲地区进入临床试验阶段的灭活疫苗有5家(其中3家来自中国大陆，另外2家分别来自我国台湾和新加坡)，他们采用的病毒株、细胞系、培养技术和免疫佐剂有所不同(表1)北京微谷生物医药有限公司(Vigoo)、中国科兴生物制品有限公司(Inovac)和中国医学科学院(CAMS)所研制的疫苗在2013年已完成了临床Ⅲ期试验，而我国台湾国家卫生研究院(NHＲI)和新加坡Inviragen公司研制的疫苗正在进行临床Ⅰ期试验(表2)。Vigoo以160、320和640U剂量加以氢氧化铝佐剂的福尔马林灭活疫苗随机接种包括12～36月龄儿童和6～11月龄婴儿在内的12000名受试者。结果显示，疫苗仍然具有较好的疫苗效能，可使约90%的受试者能抵御HFMD，80%的抵御疱疹性咽峡炎或相关神经症状。Sinovac分别以400U加以氢氧化铝佐剂的疫苗或安慰剂随机接种10077名受试者，其疫苗效能可达88%以上。CAMS则对12000名6～71月龄的婴儿和儿童随机接种了100U疫苗或安慰剂，疫苗也显示出了良好的安全性和免疫原性，但具体信息不详NHＲI研制的疫苗不仅对EV71B1、B5和C4A亚型具有较强的中和活性，对柯萨奇病毒A16也有一定的交叉中和活性在Ⅲ期试验中中国医学科学院医学生物学研究所全球首个针对肠道病毒71型（EV71）感染所致手足口病的创新疫苗通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（人二倍体细胞）英文名称：EnterovirusType71Vaccine,Inactivated（HumanDiploidCell）（1）疫苗毒种是我国流行株，具有良好的免疫原性和抗原交叉反应性。（2）细胞基质采用人胚肺二倍体细胞，有效保证在儿童群体中使用的安全性。（3）生产技术采用细胞工厂大规模培养技术，有效提高疫苗产能和质量。（4）建立的疫苗保护性评价婴猴动物模型，为开展疫苗保护性效果的系统分析和评价创造基础条件。（5）对不同基因型毒株的交叉保护试验，进一步证明该疫苗对多数基因型别的EV71感染均具有保护效果。（6）疫苗诱导免疫反应的相关研究，为进一步阐明EV71感染致病机制及疫苗免疫学机理提供了大量数据和资料。是目前国内外新型疫苗研发中的重要创新点。北京科兴生物制品有限公司自主研发的预防用生物制品1类新药益尔来福获批通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）英文名称：EnterovirusType71Vaccine,Inactivated（VeroCell）全球首创预防用生物制品1类新药对EV71所致手足口病的保护率高达94.6%对EV71所致手足口病重症和住院病例保护率为100%​稳定性良好，有效期长达3年不添加防腐剂与稳定剂，进一步降低安全风险全球最高标准控制Vero细胞宿主蛋白与DNA残留灭活疫苗仍然存在问题123EV71免疫保护机制复杂，除体液免疫外，细胞免疫也发挥着重要的作用。然而，灭活疫苗主要诱导的是体液免疫，细胞免疫不够充分。灭活疫苗生产和运输成本高昂。疫苗效力较高而疫苗价格较低的常规免疫才符合我国的成本效益，这可能会制约灭活疫苗的应用。EV71本身存在抗体依赖性增强感染现象，不恰当的疫苗接种有可能会增加重症病例的风险。参考文献[1].梁燕,赵红玲,刘龙丁,廖芸,董承红,纳锐雄,etal.肠道病毒71型灭活疫苗的规模化制备和免疫原性研究[J].中国病毒病杂志.2012(06).[2].梁争论.我国肠道病毒71型灭活疫苗研发现状[J].中国病毒病杂志.2012(06).[3].马洁,邓永强,秦成峰