辣椒疫霉菌防治中病毒诱导基因沉默技术的应用,植物保护论文

辣椒疫霉菌防治中病毒诱导基因沉默技术的应用,植物保护论文内容摘要：由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是生产中最严重的病害之一。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技术,通过瞬时表示出疫霉菌基因沉默信号,在本氏烟草(Nicotianabenthamiana)-疫霉菌互作系统中建立寄主诱导的基因沉默(host-inducedgenesilencing,HIGS)体系,为防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的本氏烟叶片上接种表示出GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,结果显示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表示出显着降低,表示清楚利用VIGS技术构建的HIGS体系在本氏烟草疫霉菌体系中可行。除此之外,选取辣椒疫霉菌致病相关基因PcAvh1、Pchmp1和PcGK4,构建到TRV2载体上,通过在本氏烟草中表示出结合接种辣椒疫霉菌,结果显示,与对照相比植物生长表型无明显变化,表示出TRV2-PcGK4的植株对辣椒疫霉菌表现抗病,表示出TRV2-PcAvh1和TRV2-Pchmp1的植株对辣椒疫霉菌的抗感性没有显着影响,表示清楚PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必须的基因之一。以上结果表示清楚,利用HIGS技术沉默辣椒疫霉菌PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌对寄主的侵染,HIGS技术可用于辣椒疫霉菌致病关键基因的挑选和鉴定。本文关键词语：VIGS;HIGS;辣椒疫霉菌;抗病;Host-inducedGeneSilencingisEffectiveagainstPhytophthoracapsiciinNicotianabenthamianaGUOYaluLIUZhengYANTingDUYuSHANWeixingCollegeofHorticulture,NorthwestAFUniversityCollegeofAgronomy,NorthwestAFUniversityAbstract：Phytophthoracapsiciisoneofthemostnotoriousdiseasesinpepperproduction.Thisstudy,weusedVIGStechniquetotransientexpressgenesilencingsignalsofPhytophthoratoestablishtheNicotianabenthamiana-Phytophthorahostinducedgenesilencing(HIGS)systemtoprovidenewideasforcontrolling.Firstofall,weinoculatedGFPlabeledPhytophthorainfestansisolate14-3-GFPonTRV-GFPandTRV-GUSexpressedN.benthamianaleaves,andobservedaclearreductionofGFPfluorescentinmyceliumof14-3-GFPonTRV-GFPplantsthancontrol,whichindicatetheHIGSisapplicableinNicotianabenthamiana-Phytophthorasystem.Furthermore,weclonedtheP.capsicivirulencerelatedgenesPcAvh1,Pchmp1andPcGK4,andconstructedthemintoTRV2vector.AfterexpressingtheminN.benthamiana,weinoculatedP.capsiciandscreenedforplantresistance.Resultsshowedthat,TRV-PcAvh1,TRV-Pchmp1andTRV-PcGK4plantsshowednodifferenceinplantgrowthandmorphology.TRV-PcGK4plantsareresistanttoP.capsicicomperingtocontrol,showedbyreducedlesionarea.ThelesionareasandP.capsicibiomassofTRV-Pchmp1andTRV-PcAvh1plantswerecomparabletocontrol.PcGK4maybeoneofthenecessarygenesforP.capsicipathogenicity.Takentogether,ourresultsindicatePcGK4isagoodtargetforHIGSandHIGStechniquecanbeusedtoscreenandidentifykeypathogenicgenesofP.capsici.寄主诱导的基因沉默技术(host-inducedgenesilencing,HIGS),指将连有病原菌目的基因片段的反义发卡构造转入寄主植物中,引发寄主植物产生与病原菌中目的基因同源的特异双链RNA(dsRNA),植物辨别dsRNA后通过核酸内切酶将其切割成21～35个碱基的SiRNA,当病原菌侵染寄主植物时,这些siRNA被病原菌吸收,使病原菌中的特定序列产生双链RNA(dsRNA),导致病原菌中的目的基因下调[1,2]。HIGS技术的优点是靶向性高、通用性强和操作简便快速,既能够鉴定病菌基因的功能,又能够控制病菌扩展,提高植物抗病性。HIGS技术已经应用在寄生植物、真菌、线虫、以及卵菌等病原系统中[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。在卵菌的应用中,利用HIGS技术将致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)效应基因PiAvr3a沉默,马铃薯植株表现出一定程度的抗病现象[13]。Jahan等[14]选取在致病疫霉菌侵染经过中起重要作用的PiGPB1、PiCESA2和PiPEC以及介入基础细胞维持的PiGAPDH基因作为HIGS靶标,发现比照野生型的非转基因马铃薯植株,沉默PiGPB1降低了致病疫霉菌的生物定殖量,植物表现抗病表型,PiGPB1在转录水平表示出量下降,转基因植物检测出特异的siRNA,讲明HIGS技术能否成功高度依靠目的基因的选择。同样,研究证明采用HIGS技术提高了莴苣对霜霉病菌卵菌盘梗霉(Bremialactucae)的抗性[12]。以上研究表示清楚,HIGS技术在植物-卵菌互作中能够有效利用。以上卵菌HIGS研究均采用RNAi载体稳定转化植物,试验周期较长,工作量较大。病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技术可快速地在植物中实现瞬时沉默,已用于真菌HIGS研究[15],有潜力用于提高HIGS研究效率。本研究通过采用VIGS技术在寄主植物中表示出疫霉菌基因片段,研究其用于提高HIGS效率鉴定疫霉菌致病关键基因的潜力。致病疫霉菌Pihmp1编码吸器细胞膜特异蛋白,其沉默显着减弱致病疫霉菌的致病性[16];G蛋白偶联受体蛋白基因GK4与致病疫霉菌的孢子萌发、菌丝生长发育以及毒性功能相关[17];PcAvh1是辣椒疫霉菌的一个RXLR效应蛋白基因,具有重要的毒性功能[18];SGT1介入植物防卫信号和抗病途径[19],其沉默导致植物表现更感病,植株生长矮小,叶片皱缩卷曲;PDS(八氢番茄红素脱氢酶)介入植物类胡萝卜素的合成,其沉默导致叶片出现白化现象[20]。本试验以GUS、GFP、PDS和SGT1作为报告基因,研究基于VIGS基因瞬时沉默技术的HIGS技术用于本氏烟草-疫霉菌互作的潜力。1材料与方式方法1.1材料培养基LB、CA、RSA、抗生素卡那霉素、四环素、农杆菌感受态C58C1、大肠杆菌感受态DH5、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株1112、致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)菌株14-3-GFP、病毒载体TRV1和TRV2均为笔者所在实验室配制与保存。所用试剂主要有高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶、rTaqDNA聚合酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等。所用仪器主要有Eppendorf4308电击仪、PCR仪(BioRad)、荧光显微镜(Olympus)、旋转摇床及生化培养箱等。1.2方法1.2.1载体构建试验所用引物见表1,克隆基因PcGK4(PITG_05519)、PcAvh1(EU282489.1)和Pchmp1(PITG_00375),酶切目的基因与TRV2载体片段,用T4连接酶进行连接,产物通过电击转化大肠杆菌感受态细胞,培养在选择培养基上,采用菌落PCR方式方法检测阳性克隆,测序确认载体构建成功。1.2.2质粒转化及农杆菌注射载体构建成功后,电击转化农杆菌C58C1感受态。挑取阳性单菌落培养在带有抗性的液体LB培养基中至OD600为0.8～1.0,收集菌体,配制加有乙酰丁香酮(110-4mol/L)的MES重悬液,重悬菌体OD600为0.6,将TRV1和TRV2按体积比1∶1混合后室温静置1～3h,用注射器注射3周左右本氏烟草的第1片和第2片真叶,选择TRV2-GUS,TRV2-SGT1作为对照,TRV2-PDS作为报告基因,每个试验组选取8棵植物,注射18d后进行后续试验。表1引物序列1.2.3离体叶片接种致病疫霉菌及荧光观察致病疫霉菌中参加5mL预冷的无菌蒸馏水,至菌丝完全浸润,置于4℃,用2h观察游动孢子的释放,并于显微镜下计数。取TRV2-GUS和TRV2-GFP叶片涮洗干净,吸干多余水分用湿水脱脂棉包裹叶柄处,放于底部铺有湿水滤纸的塑料托盘中,在叶子左右两边对称位置各接种1000个致病疫霉菌的游动孢子(15～20L),保鲜膜封闭后放置于16℃黑暗培养箱,3d后观察发病情况。用刀片划取小块平整致病疫霉菌侵染的病斑区域置于载玻片上,用水浸润后用盖玻片压片,用奥林巴斯荧光显微镜(BX-51TRF,滤光器BP450-480)进行初步观察并进行图像采集。1.2.4离体叶片接种辣椒疫霉菌及病斑统计参考Fan等[21]的方式方法培养辣椒疫霉菌及诱孢,取TRV2-GUS、TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1叶片,在叶片左右两边对称位置各接种辣椒疫霉菌的游动孢子1000个(10～12L),放于25℃黑暗保湿培养,2d后观察发病情况,并测量病斑直径计算病斑面积和显着性分析(*代表P0.05,**代表P0.01)。1.2.5半定量测定辣椒疫霉菌的定殖量接种辣椒疫霉菌2d后,用打孔器收取接种点周围病斑组织,参考Fan等[21]用CTAB法提取组织DNA,本氏烟草、辣椒疫霉菌内参基因NbActin、PcActin(表1)引物序列参照Fan等[21]和Zhang等[22]的研究。半定量RT-PCR方式方法程序设置为:95℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火,延伸80s,28个循环,PCR产物电泳跑胶后用化学发光成像系统(BIO-RAD)拍照。2结果与分析2.1基于VIGS的本氏烟草-疫霉菌HIGS体系的建立为确定VIGS载体能否能够成功应用于疫霉菌HIGS研究,在TRV2-GUS和TRV2-GFP的叶片上接种带有GFP标记的致病疫霉菌株,观察致病疫霉菌菌丝中的GFP荧光。图1显示,比照对照TRV2-GUS和TRV2-GFP病斑区域的绿色荧光明显减弱,讲明TRV2-GFP成功沉默了致病疫霉菌菌丝中的GFP。表示清楚本研究利用VIGS技术在本氏烟草中可实现疫霉菌基因的沉默,为挑选和鉴定能够抑制辣椒疫霉菌侵染的靶标基因提供根据。图1TRV2-GFP成功沉默了GFP标记的致病疫霉菌株中的GFP在TRV2-GUS和TRV2-GFP叶片上接种致病疫霉菌14-3-GFP的游动孢子GFPlabeledP.infestansisolate14-3-GFPzoosporeswereinoculatedwithTRV2-GUSandTRV2-GFP;3d后，使用奥林巴斯荧光显微镜〔BX-51TRF，过滤器BP450-480〕在白平衡处理4倍镜下进行观察并拍照After3days,Olympusfluorescencemicroscope(BX-51TRF,filterBP450-480)wasusedandpicturesweretakenunder4timesocularwithwhitebalance2.2基于VIGS的候选基因同源siRNA的表示出对植株生长表型的影响本研究将对照基因GUS、GFP、SGT1和辣椒疫霉菌基因Pchmp1、PcGK4和PcAvh1构建到TRV2载体,通过农杆菌介导的瞬时转化在本氏烟草上进行表示出,农杆菌转化18d后观察植物表型,结果显示报告基因TRV2-PDS出现白化现象,TRV2-SGT1表现植株矮小,叶面卷曲,TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1比照对照TRV2-GUS在植株大小、叶片颜色及形态方面没有明显变化(图2)。图2沉默候选基因18d后本氏烟草的生长表型2.3表示出TRV2-PcGK4的植物接种辣椒疫霉菌后的表现对TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1的离体叶片接种辣椒疫霉菌的游动孢子,2d后观察病斑,结果显示,与对照TRV2-GUS相比,TRV2-PcGK4叶片上的病斑面积显着减小(图3-A,3-B),植物表现抗病表型,表示清楚PcGK4在辣椒疫霉菌侵染的经过中起关键作用。TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1的病斑面积与对照TRV2-GUS无显着差异,植物无明显抗病表型(图3)。2.4辣椒疫霉菌的定殖量在TRV2-PcGK4中的表现对辣椒疫霉菌侵染的TRV2-GUS、TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1的叶片病斑进行打孔收样,用CTAB法提取基因组DNA,以本氏烟草和辣椒疫霉菌的内参基因作为引物,通过半定量RT-PCR测定辣椒疫霉菌生物量。结果显示,本氏烟草内参基因条带在对照TRV-GUS以及TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1、TRV2-PcAvh1植物样品中亮度一致,而辣椒疫霉菌内参基因条带在TRV2-PcGK4样品中比对照TRV2-GUS亮度明显减弱(图4-A),表示清楚定殖在TRV2-PcGK4中的辣椒疫霉菌生物量显着降低。TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1检测出的辣椒疫霉菌内参基因条带与对照亮度无明显差异,表示清楚定殖在上述样品中的辣椒疫霉菌生物量没有变化(图4-B,4-C)。图3TRV-PcGK4植物表现出对辣椒疫霉菌的抗性A、C、E为病斑面积统计情况A,CandErepresentstatisticalanalysisoflesionarea;B、D、F为接种辣椒疫霉菌2d后的叶片B,DandFrepresentleavesinoculatedwithP.capsiciafter2days。本氏烟草重复3次结果一致，每个柱形图中用于分析的病斑面积来自于8片叶片，采用t检验进行统计学分析，**表示P0.01Theexperimentswererepeatedthreetimeswithsimilarresults(nonesidedStudentsttest，**indicatingP0.01图4病斑部位辣椒疫霉菌生物量检测行辣椒疫霉菌的生物量检测RNAsfromleavesat2daysafterP.capsici1112inoculationwasusedforP.capsicibiomassquantification;1和2使用辣椒疫霉菌内参引物1and2usingtheP.capsiciinternalprimerforamplification;3和4使用本氏烟草内参引物3and4usingN.benthamianainternalprimerforamplification;2和4以TRV2-GUScDNA为模板2and4UsingTRV2-GUSastemplate;1和3以TRV-PcGK4,TRV-Pchmp1,TRV-PcAvh1cDNA为模板1and3usingTRV-PcGK4orTRV-Pchmp1orTRV-PcAvh1astemplate；本氏烟草内参基因条带大小为600bp，辣椒疫霉菌内参基因条带大小为179bpThesizeofthebandfromN.benthamianainternalgeneis600bp,andfromP.capsiciinternalgeneis179bp；该试验结果在3次生物学重复中表现一致Theexperimentwasrepeatedthreetimeswithsimilarresult3讨论VIGS是利用植物对RNA病毒防御机制发展起来的一项技术,当前应用于卵菌HIGS的研究还未见报道。本研究将VIGS技术应用于疫霉菌HIGS研究,通过在TRV2-GFP和对照TRV2-GUS的叶片上接种带有GFP标签的致病疫霉菌,发现TRV2-GFP病斑区域的致病疫霉菌菌丝中的GFP显着降低,证明VIGS技术在卵菌HIGS体系中可行。随后成功挑选到在辣椒疫霉菌侵染经过中起关键作用的候选基因PcGK4。在植物病原菌传播和感染寄主的经过中,病菌孢子构成和发病机制由包括g蛋白和磷脂信号的细胞信号网络调控。卵菌GPCR-PIPKs(GKs)蛋白家族由7个跨膜构造域(7-TM)和磷脂酰肌醇磷酸酯激酶(PIPK)构造域组成,在这里基础上GKs有可能连接g蛋白和磷脂信号通路。致病疫霉菌GK4是G蛋白偶联受体,属于GKS(GPCR-PIPKS)蛋白家族,GK4基因的沉默和过表示出不仅介入孢子萌发和菌丝延伸,而且介入孢子囊的裂解和早期侵染,在致病疫霉菌的侵染经过中起重要作用[20]。本研究同样发现沉默辣椒疫霉菌PcGK4后能够显着降低辣椒疫霉菌的致病力,讲明PcGK4在辣椒疫霉菌侵染经过中起关键作用。并不是所有的目的基因沉默后都能够抑制病原菌侵染[13],目的基因的选择直接决定沉默效率的高低。本试验挑选到的PcGK4能显着抑制辣椒疫霉菌的侵染,Pchmp1和PcAvh1处理的植物比照对照没有明显的抗病表型。分析原因,可能是在辣椒疫霉菌中存在Pchmp1功能冗余基因或者该基因没有成功被沉默。PcAvh1已被报道是辣椒疫霉菌中的一个重要的RXLR毒性效应分子,在辣椒上能够引起严重的黄化褪绿现象[20],但在本试验中没有表型,可能是由于该基因在侵染初期高量表示出,没有被HIGS有效沉默。HIGS技术当前已应用于多个病原菌系统中,但在卵菌系统中存在争议,在Zhang等[22]的报道中,利用HIGS技术以寄生疫霉菌的PnPMA1基因(内源质膜氢离子通道蛋白)和报告基因GFP为研究对象进行试验,结果显示转化dsGFP的拟南芥未干扰寄生疫霉菌中的GFP荧光信号,寄生疫霉菌的靶标基因PnPMA1转录水平未遭到影响,同样从病原组织分离的疫霉菌中未检测到同源靶基因siRNA分子的存在。在之后Sanju等[13]的报道中,以马铃薯为寄主植物,对致病疫霉菌Avr3a基因运用HIGS技术进行沉默,比照非转基因植株,转基因植株Avr3a基因的表示出量下降,致病疫霉菌的生物定殖量降低,转基因植物特异地表示出siRNA,证明HIGS技术在马铃薯-致病疫霉菌系统中能够有效应用。Jahan等[14]发现转化dsGFP的马铃薯成功沉默了致病疫霉菌菌丝中的GFP基因。与Jahan等[14]研究结果类似,本研究利用TRV载体在本氏烟草中也沉默了致病疫霉菌菌丝中的GFP信号。比照Zhang等[22]在拟南芥中的研究,笔者以为可能是寄主植物的差异导致HIGS技术在卵菌中的应用上产生了差异。HIGS技术应用在辣椒疫霉菌研究中的报道比拟少见,Vega-Arregun等[23]利用HIGS技术对一个被烟草(N.tabacum)辨别的效应蛋白PcAvr3a1进行沉默,结果促进了辣椒疫霉菌在非寄主烟草(N.tabacum)上的定殖,表示清楚HIGS技术在辣椒疫霉菌体系中应用可行,但并没有牵涉抑制辣椒疫霉侵染的相关基因,本试验初次利用HIGS技术挑选到抑制辣椒疫霉菌侵染的基因PcGK4,对辣椒疫病的防控有指导意义。现前阶段,HIGS技术非常关键的科学问题是怎样证明植物产生的siRNA成功进入病原菌细胞并且诱导了靶标基因的沉默,siRNA是通过何种途径向疫霉菌进行转运和累积的,在这些方面未有成熟的机制阐述。本试验中固然挑选到沉默PcGK4在植物中具有抗病表型,但没有检测候选基因能否成功进行沉默,之后能够通过定量PCR,Northernblot和RNA测序的方式方法检测疫霉菌中目的基因的沉默,并且能够在辣椒疫霉菌真正的寄主植物辣椒上验证之前的结果,解析PcGK4介入辣椒疫霉菌侵染的机理。以下为参考文献[1]ESQUELA-KERSCHERA,SLACKFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer[J].NatureReviewsCancer,2006,6(4):259-269.[2]NUNESCC,DEANRA.Host-inducedgenesilencing:atoolforunderstandingfungalhostinteractionandfordevelopingnoveldiseasecontrolstrategies[J].MolecularPlantPathology,2020,13(5):519-529.[3]WESTWOODJH,RONEYJK,KHATIBIPA,etal.RNAtranslocationbetweenparasiticplantsandtheirhosts[J].PestManagementScience,2018,65(5):7.[4]LILLEYCJ,BAKHETIAM,CHARLTONWL,etal.RecentprogressinthedevelopmentofRNAinterferenceforplantparasiticnematodes[J].MolecularPlantPathology,2007,8(5):701-711.[5]ZHANGT,JINY,ZHAOJH,etal.Host-inducedgenesilencingofthetargetgeneinfungalcellsconferseffectiveresistancetothecottonwiltdiseasepathogenVerticilliumdahliae[J].MolecularPlant,2021,9(6):939-942.[6]CHENGW,SONGXSH,LIHP,etal.Host-inducedgenesilencingofanessentialchitinsynthasegeneconfersdurableresistancetoFusariumheadblightandseedlingblightinwheat[J].PlantBiotechnologyJournal,2021,13(9):1335-1345.[7]KOCHA,KUMARN,WEBERL,etal.Host-inducedgenesilencingofcytochromeP450lanosterolC14-demethylase-encodinggenesconfersstrongresistancetoFusariumspecies[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2020,110(48):19324-19329.[8]NOWARAD,GAYA,LACOMMEC,etal.HIGS:host-inducedgenesilencingintheobligatebiotroph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