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文档简介

多聚酶链式反应（PCR）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术

一、实验目的多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增二、实验原理1、变性（94℃）：使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA2、退火（55℃）：引物和其互补的模板在局部形成杂交链3、延伸（72℃）：通过Taq

DNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从5`向3`端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。二、实验原理

二、实验原理以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。双链DNA分子双链断开

循环1模板与引物结合循环1TaqTaq循环1TaqTaq循环1循环1双链断开循环2模板与引物结合循环2TaqTaqTaqTaq循环294℃变性双链断开循环3循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq循环3循环n水稻总DNAPCR仪，台式离心机，电泳仪，电泳槽2ml离心管架，移液枪，1.5ml离心管，0.2ml离心管，枪头dNTP，Taq酶，引物一对（RM1F，RM1R），10×PCR反应缓冲液，灭菌双蒸水，三、实验材料、仪器及试剂

1、PCR反应混合液的制备

2μlDNA

0.4μldNTP（10mM）

1.5μl引物F（2μM）RM1F

1.5μl引物R（2μM）RM1R

0.3μlTaq酶（5U/μl）

2.0μl反应缓冲液（含15mMMgCl2）

13μlddH2O

混匀，放入PCR仪中开始反应四、实验步骤

1、PCR反应混合液的制备（n为反应数）

n×2μlDNAn×0.4μldNTP（10mM）

n×1.5μl引物F（2μM）RM1Fn×1.5μl引物R（2μM）RM1Rn×0.3μlTaq酶（5U/μl）

n×2.0μl反应缓冲液（含15mMMgCl2）

n×13μlddH2O

混匀，放入PCR仪中开始反应四、实验步骤2、PCR反应程序设计如下

94℃，预变性5分钟

94℃，变性1分钟

55℃，退火1分钟30个循环

72

℃，延伸1分钟

72

℃，延伸5分钟所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染所有PCR试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水所有试剂都应该以大体积配

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