实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离血清

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分离血清蛋白质目的1强化学生对电泳基本原理的理解与记忆。2熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理、学会操作。原理带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。混合物中各组分在电场中的泳动速度，首先和本身所带的净电荷多少、分子量大小和形状有关。一般来说，带电越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的，则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。区带电泳的分类

1．按支持物物理性状不同，可分为：(1)滤纸及其他纤维素膜如乙酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚胺纤维膜电泳。(2)粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。(3)凝胶电泳，如琼脂糖、琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。(4)丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。2．按支持物的装置形式不同，可分为：(1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳。(3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。3．按pH的连续性不同，可分为：(1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。(2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。

聚合反应常用的催化剂有过硫酸胺及核黄素。为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，且可通过控制Acr的浓度或Acr与Bis的比例合成不同孔径的凝胶，以适用于分子大小不同物质的分离。

聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径

SDS（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。下面就SDS的基本原理做简单介绍。

SDS－PAGE电泳的基本原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，向阳极移动。图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白得到同行专家赞蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000KD到200000KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。分类

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类：1.连续系统2.不连续系统：不连续电泳含两层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液。浓缩胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液分离胶：小孔径，pH8.8～8.9Tris-HCl缓冲液

本实验采用SDS对血清蛋白进行分离，考马斯亮蓝R-250染色，经脱色后，观察其组成和相对含量(血清蛋白通过SDS一般可分出12-16条区带)。实验试剂和器材1.高分子量标准蛋白试剂盒:

兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白

MW=66,200

兔肌动蛋白

MW=43,000

牛碳酸酐酶

MW=31,000胰蛋白酶抑制剂

MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶

MW=14,400

置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。2.样品：兔血清3.30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr29g，甲叉双丙烯酰胺

（Bis）1g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中4℃储存

4.10%SDS（十二烷基磺酸钠）5.10%过硫酸铵(AP)6.TEMED（四甲基乙二胺）7.2x上样缓冲液：10%SDS（4ml）+巯基乙醇（1ml）+0.2%溴酚蓝（2ml）+甘油2ml+1MpH6.8Tris-HCl（1ml）8.浓缩胶缓冲液（1MTris-Cl缓冲液pH6.8）9.分离胶缓冲液（1.5MTris-Cl缓冲液pH8.8）10.固定液：取乙醇500ml，冰乙酸100ml混匀，定溶至1000ml。11.染色液：称取考马斯亮蓝R2501.25g，甲醇225ml，冰乙酸50ml，双蒸水225ml.12.脱色液：冰乙酸80ml，乙醇250ml，加蒸馏水定容至1000ml。13.电泳缓冲液（SDS20g，Tris60g,甘氨酸282.2g,pH8.3）加蒸馏水使其溶解后定容至2000ml。

实验器材垂直板电泳装置电泳仪制胶架移液枪移液管烧杯培养皿离心机实验步骤

1.安装膜具

1）将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。

2）称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后灌胶。

2.制备SDS聚丙烯酰胺凝胶

1）制备分离胶30%丙烯酰胺5ml+分离胶缓冲液5ml+10%SDS0.2ml+10%过硫酸铵0.2ml+蒸馏水9.6ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用

移液管加入1-2cm的蒸馏水，静止，待凝胶聚合后（约30min），去除水相，然后用吸水纸吸干残余的水。

2）制备浓缩胶30%丙烯酰胺1.32ml+浓缩胶缓冲液1ml+10%SDS0.08ml+10%过硫酸铵0.08ml+蒸馏水5.6ml;混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（不能混入起泡），静止，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。3）先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。

3.样品预处理

取0.5ml样品加入0.5ml上样缓冲液，置沸水中煮5分钟。

4.上样

1）第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液

2）其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品

5.电泳

接通电源，将电压调至80V、50mA。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到150V、80mA，电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm处，停止电泳

6.固定

取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液

7.染色脱色

培养皿中倒入50-60度预热的染色液浸没凝胶，约40分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，防止2小时，期间换脱色液2-3次注意事项

1．丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤，呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。

2．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

3．对多种蛋白而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂。4.