第二章 菌种制备

第二章菌种制备微生物的菌种制备在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括以下四方面：①菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。②菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。③菌种的保藏：一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。④退化菌种的复壮：如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。一、菌种制备微生物资源及其丰富，它们栖居了自然界的各个角落。按研究和生产的需要进行采集，经过反复分离筛选获得需要的抗生素产生菌，成为原始菌种。原始菌种往往产量较低，发酵时易产生色素和伴生大量不需要或有害的其他代谢产物，需进一步选育或基因重组获得生产上需要的高产优良菌种，生产上习惯称为产生菌种。抗生素产生菌的分离和筛选土壤微生物的分离采土：到富集抗生素产生菌的土壤中采土分离：取5～10g土样，以无菌水稀释1000～10000倍，吸取0.05ml涂布于培养基上。一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样

增殖培养

纯种分离纯培养生产性能测定方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1．稀释分离法2．平板划线分离法

⑴

涂菌：

⑵

划线分离：①分步划线法；②一次划线法：

3．组织分离法

测定代谢产物或其它目的性状筛选从大量待筛的微生物中，尽快鉴别少数有应用价值的抗生素产生菌的实验过程。要根据筛选的目的，选择合适的筛选方法。方法：琼脂移块法、发酵液扩散法、筛选抗肿瘤抗生素法、抗病毒抗生素的筛选、酶抑制剂的特异筛选方法。纸片培养显色法

透明圈法琼脂块培养法

二、菌种选育的经典方法自然选育诱变育种自然选育概念：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，选择维持原有生产水平的菌株的纯种选育的方法。进一步选育或保藏移种生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落斜面种子(初筛)高产菌株沙土管菌株斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验自然选育流程图筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢

以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。（一）诱变育种的一般步骤和方法

出发菌株

同步培养

使菌细胞处于相同或接近的生理状态

单细胞（或单孢子）菌悬液的制备

单细胞或单孢子的意义

酵母或霉菌孢子106/ml、细菌108/ml

诱变剂的选择及其剂量的确定

以致死率为90％～99％

为宜

诱变处理

①物理诱变剂

②化学诱变剂

确定出发菌株

↓菌种的纯化选优

↓←出发菌株的性能鉴定同步培养

↓制备单细胞（或单孢子）悬液

↓←活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验

↓诱变处理

↓平板分离

↓计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养

↓突变体的初步筛选

↓←用简单快捷的方法重复筛选

↓←摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）二、微生物的诱变育种三、现代菌种选育技术1、杂交育种：指两个不同基因型的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。一般包括以下过程：标记菌株的选择→异核体的形成→杂合二倍体的形成→重组体的转化→重组体遗传性状的分析2、原生质体融合育种原生质体融合育种

细胞（A+B—）

细胞（A—B+）

脱壁处理

脱壁处理

原生质体（A+B—）

原生质体（A—B+）

混合

加融合剂

原生质体融合

涂平板（原生质体再生）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）3、基因工程育种程序：1、目的基因的准备2、载体系统3、基因与载体连接4、转化5、重组体的筛选和表达产物的鉴定防止菌种退化的措施

1．控制传代次数

2．创造良好的培养条件

3．利用不同类型的细胞进行移种传代

4．采用有效的菌种保藏方法四、菌种的保藏

1．低温保藏法斜面菌种直接放入0～4℃冰箱中保藏，保存时间不宜过长，一般为

3～6个月；用-20℃以下的超低温冰箱或干冰、液氮（-195℃）冻结保藏，长达数年。

2．干燥保藏法主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。这种保藏方法主要适合于细菌的芽胞和霉菌的孢子。细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。

3．隔绝空气保藏法用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，

4．真空冷冻干燥保藏法其基本过程是：培养菌种→加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）→分装、预冻→真空冻干→真空封口。

培养基的制备在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺也不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种。在种子的培养阶段和不同的发酵时期，其营养的要求也不完全一样。因此需根据其不同要求来选用培养基的成分和配比。其主要成分包括：碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）、前体等培养基各成分说明碳源：主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要成分。氮源：主要用以构成菌体细胞物质和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。无机盐和微量元素：抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长。繁殖和产生生物成品过程中，需要某些无机盐类和微量元素，其浓度与菌种的生理活性有一定的影响。前体：在抗生素合成中，菌体利用它构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质称为前体。前体除参与产物合成，在一定的条件下还控制合成抗生素的方向和抗生素的产量。孢子制备生产用的菌株需经纯化和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5～7天或7天以上，必要时还可以进一步用扁瓶在固体培养基上扩大培养。种子制备其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养。或者直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩