真菌药敏试验方法比较

关于真菌药敏试验方法比较第一页，共26页幻灯片真菌药敏试验临床难以开展的原因1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定3.纸片法试验未得到NCCLS认可4.E试验价钱太贵5.药敏孵育时间因菌种而不同第二页，共26页幻灯片体外敏感试验与临床治疗相关性真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用第三页，共26页幻灯片真菌体外药物敏感试验方法

NCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法E-test法NCCLSM44-P纸片扩散法(仅限氟康唑)

丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)

第四页，共26页幻灯片

真菌体外药敏用培养基

常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：

RPMI 10.4g

MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸） 34.53g 蒸馏水900ml溶解后，用1MNaOH调节PH至7.0（25℃），用蒸馏水溶至1000ml，高压灭菌后，冷却至50℃加入RPMI1640用0.22µm滤膜抽滤除菌，4℃保存。

第五页，共26页幻灯片真菌体外药敏用培养基

E-test法：

在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。NCCLS纸片扩散法：

Mueller-Hinton琼脂补充2%葡萄糖和0.5μg/ml美蓝丹麦ROSCO纸片扩散法：

改良的SHADOMY（PH7.0）培养基主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。第六页，共26页幻灯片菌液制备将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.5~2.5×103CFU/ml

微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍接种浓度约为1～5×103CFU/mlE-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。Rosco纸片扩散法：1.念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(1~5×105CFU/ml)2.隐球菌属： 1.0麦氏浊度3.其它酵母菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释第七页，共26页幻灯片常量肉汤法(M27-A)先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640µg/ml,终末浓度为1.25µg/ml，分装无菌洁净的12mm×75mm试管：

64321684210.5.25.125＋－前10管：0.2ml氟康唑＋1.8ml菌液念珠菌属35

℃孵育48小时新型隐球菌72小时读取MIC结果2ml菌液1.8ml1640第八页，共26页幻灯片常量稀释法

药敏结果判定

氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%抑制其他唑类药物为80%抑制（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度）质控株克柔念珠菌ATCC6258

近平滑念珠菌ATCC22019

白念珠菌ATCC90028

白念珠菌ATCC24433

第九页，共26页幻灯片微量肉汤法

氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2×常量法的浓度（即128µg/ml），终浓度为0.25µg/ml。

。37℃。37℃6432168421.5.25.125＋－氟康唑：1-10孔分别为100ul菌悬液：1-10孔分别为100ul200ulRPMI汤200ul菌悬液

35℃ 新型隐球菌72小时，其余菌株48小时读取MIC结果第十页，共26页幻灯片酵母菌的NCCLSM27-A各药物折点

粘膜及系统性感染：氟康唑（除克柔念珠菌）敏感： ≤8µg/ml

中介： －耐药： ≥64µg/ml粘膜感染：伊曲康唑敏感： ≤0.125µg/ml

中介： －耐药： ≥1µg/ml粘膜及系统性感染：5-氟嘧啶敏感： ≤4µg/ml

中介： 8~16µg/ml

耐药： ≥32µg/ml第十一页，共26页幻灯片酵母菌E-test法

瑞典ABBiodisk

优点：有较好的重复性和稳定性

MIC第十二页，共26页幻灯片E-test法

0.5麦氏比浊液（约为1~5×106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上

35℃培养24小时读取结果

光滑念珠菌新型隐球菌等生长较慢的菌种需适当延长培养时间。第十三页，共26页幻灯片E-test法评价

准确性高,且操作简便E-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反映药物对致病菌的敏感性缺点：1.价格太高每片40-50元2.吡咯类MIC终点不好确定第十四页，共26页幻灯片酵母菌纸片扩散法敏感试验

NCCLSM44-P.2003

培养基：Mueller-Hinton琼脂补充2％Glucose

0.5ug/mlMethylenebluedyePH7.2-7.4优点：有较好的重复性和稳定性 操作简便，价廉缺点：目前只限氟康唑

第十五页，共26页幻灯片NCCLS纸片扩散法

0.5麦氏比浊标准（约为1~5×106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上步骤同细菌敏感试验操作一致，35～37℃孵育18～24小时，对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需调至1麦氏单位，孵育48小时，光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。第十六页，共26页幻灯片酵母菌纸片扩散法敏感试验

NCCLS

M44-P.2003

氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度

抑菌环直径（mm)

MIC（ug/ml)敏感（S)>=19<=8剂量依赖性敏感（SDD)15-1816-32耐药（R)<=14>=64S＝SusceptibleSDD=Susceptible－DoseDependentR=Resistant

第十七页，共26页幻灯片酵母菌纸片扩散法敏感试验NCCLSM44-P.2003氟康唑对标准菌株24h抑菌环直径（mm)的质控允许范围标准菌株 氟康唑25ug 沃尔康唑1ug白念珠菌ATCC90028 28-39 31-42 近平滑念珠菌ATCC22019 22-33 28-37

热带念珠菌ATCC750 26-37 －克柔念珠菌 ATCC6258 － 16-25

第十八页，共26页幻灯片ROSCO纸片扩散法

ROSCO纸片扩散法：1.克柔念珠菌： 0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀释 菌液为5×105CFU/ml2.隐球菌属： 1麦氏浊度3.其它酵母菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释 菌液为2.5×106CFU/ml将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（PH7.0）培养基上其它操作同细菌。第十九页，共26页幻灯片

读取抑菌环直径近似到mm在大约80%抑制区为测量边界在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落，<15可忽略不计Rosco纸片扩散法药敏结果判定第二十页，共26页幻灯片两种纸片扩散法的比较Rosco纸片扩散法检测菌种念珠菌属，隐球菌属培养基改良SHADOMY琼脂，PH7.0试验药品及剂量AMB10µg，IT8µg，FLA15µg，FC1，10µg，FC10µg，KET15µg等接种的菌量：5×105CFU/ml（克柔念珠菌先制成0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10。隐球菌属配1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度，1：1稀释培养条件念珠菌属35℃培养18~24小时，新型隐球菌30℃培养42~48小时结果判读FC及AMB100%被抑制唑类药物80%抑制质控株光滑念珠菌2238NL

白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550NCCLS纸片扩散法

检测菌种念珠菌属，隐球菌属培养基Mueller-Hinton琼脂中补充2%的葡萄糖和0.5μg/ml的美蓝试验药品及剂量FLA25µg接种的菌量1～5×106/mL隐球菌1.0麦氏浊度培养条件35

℃孵育18～24小时新型隐球菌培养42~48小时结果判读FC及AMB100%被抑制，唑类药物80%抑制质控株白念珠菌ATCC90028近平滑念珠菌ATCC22019

第二十一页，共26页幻灯片Rosco纸片扩散法各药物折点粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug，特比奈吩，咪康唑等敏感：≥20mm 中介：12~19mm

耐药：≤11mm两性霉素B，制霉菌素伊曲康唑敏感：≥15mm

中介：10~14mm

耐药：无抑菌环氟胞嘧啶10ug敏感：≥30mm用于黑曲霉

中介：23~29mm

耐药：≤22mm灰黄霉素敏感：≥10mm

中介：－

耐药：无抑菌环第二十二页，共26页幻灯片

系统性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏感：≥30mm ≤4 中介：29~23mm 8-16耐药：≤22mm ≥32 伊曲康唑8ug18-24h 敏