第五章连转筛

第五章连转筛第1页，共15页。

一、DNA片段的重组连接目的基因和载体DNA是重组的基本构件。

DNA片断的重组连接是目的基因与载体的连接。

获得目的基因后必须将其放在一定的载体上才能进入宿主细胞扩增或表达。载体（bus）将目的基因（乘客）送到宿主细胞（理想的天堂）去繁衍生息，春花秋实，建功立业。

习惯上将目的基因与载体连接及其后续的转化过程称为克隆，可能是目的基因＋载体形成一个新的DNA重组分子（新的genotype），后者必然会产生一个新的菌体克隆（phenotype）。

第2页，共15页。限制酶剪切或机械剪切目的基因或载体可以产生粘端和平端的DNA分子。催化二者重组连接（粘端或平端）反应的酶常用T4DNAligase。第3页，共15页。（一）粘性末端连接

1.利用相同的酶切位点——单酶单切点

用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。geneEcoRⅠvectorEcoRⅠ

问题与解决办法：

（1）自身环化

粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体－>若转化则出现假阳性克隆。

解决办法是

用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶（AP：BIP/CIP）处理载体，去除5‘－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。

（2）不能定向克隆/插入

由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按5‘－3’方向克隆在启动子下游而不能反之。此时只能靠运气了。第4页，共15页。2.利用不同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆）优点（1）避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；（2）可控制外源基因插入方向。构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。E.coRⅠgenePstⅠEcoRⅠvectorPstⅠ

3.利用同裂酶，分别切割目的基因/载体，产生相同粘端，因而可以连在一起，如：

5’——GGATCC——3’Saw3AIgeneBamHIvector3’——CCTAGG——5’

构建表达载体时，同裂酶也很有用。ligase第5页，共15页。(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframagaroseAPOAIPUCQ-APOAIPBR325-APOAIPUC9PUC9APOAIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIFigure8-3strategyofconstructionofrecombinantpucq-APOAIplasmiaE.coli第6页，共15页。*4.（1）3’端突出只能切平是因为DNApol合成需要引物（加在3’－OH末端）且只能按5’－3’方向。（2）切平填平图示：5’合成填平5’3’切平

3’5’核酸酶切平3’5’5’—突出末端3’—突出末端（3）切平除用于重组连接外，还可用于阅读框修改，如：

EcoRⅠ5’—GATCGAATTC—3’5’GATCG-----1.目的基因、载体平端平端直接连接

没有合适的产生粘端的限制酶切位点，可采用平端连接，但连接效率<粘端。并且连接反应中更偏向于载体自身环化，拟用下述措施可提高连接效率。措施：（1）大大增加ligase量，有人估算是粘端同等条件的100倍。（2）增加目的基因DNA分子量，增加与载体碰撞的机会。（3）BIP或CIP去除载体两端5’—P基团，防止环化。第7页，共15页。（二）平头末端的连接平端的4个来源载体目的基因连接或克隆策略①少数限制酶如HaeⅡ对称切产生平端√√cDNA①目的基因载体平端平端连接②机械剪切如皮试小头针挤压DNA产生平端√√cDNA②加人工接头连接（cDNA/vector）③逆转录生成cDNA是平端√cDNA③用衔接接头取代人工接头连接（cDNA/vector）④5’端突出，用酶切平，或用酶填平3’端；3’端突出只能切平，不能填平产生平端√√cDNAcDNA④通过同聚尾连接(cDNA/vector)⑤T载体，PCR产物T/A克隆法⑥PCR引入限制酶切位点第8页，共15页。平端目的基因DNA

EcoRⅠ甲基化酶加linker（已磷酸化加了5’—P）

PGG↓AATTCCGG↓AATTCCCCTTAAGGCCTTAAGGPT4ligase平端连接形成交聚接头GGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGGGGAATTCCGGAATTCC---CCTTAAGGCCTTAAGG---EcoRIAATTCCGGGGCCTTAA

在目的基因末端连上人工接头与同样酶切（EcoRⅠ）的载体连接

2.加人工接头连接人工接头（linker，接头）是指人工合成的，连接目的基因两端的含有某些限制酶位点的寡核苷酸片段，如含EcoRⅠ的linker与目的基因的连接图示如下。第9页，共15页。

*采用此方法可能存在下述问题：目的基因含1个或多个与linker相同的酶切位点如EcoRⅠ，将受到损害，克服办法有：

（1）加linker前用甲基化酶保护目的基因（如EcoRⅠ甲基化酶）。

(2)用哺乳动物DNA切点稀少的限制酶切位点合成linker如SalⅠ/NotⅠ，平均100/1000bp才可能出现1个酶切位点。这样目的基因被切几率就很小。（3）用adaptor取代linker连接。第10页，共15页。

3.用衔接头代替人工接头连接（adaptor与linker区别是本章第一个难点）衔接头（adaptor，套头，适应子）是一种人工合成的短双链寡脱氧核苷酸，一端是可与目的基因双链（如cDNA）连接的平头末端，一端是可与载体连接的粘性末端。与linker不同，在加到cDNA分子之后套头不需要用限制酶降解，与脱磷酸化具有同样粘性末端的载体相连。

Linker（多聚接头）或adaptor（多聚套头）的限制酶切下的小片段或衔接形成的双体套头可用电泳或层析法分离，以后者得到推荐。

adaptorgeneadaptorvector第11页，共15页。4.通过同源多聚尾连接dC：dG同源多聚尾是连接DNA片段克隆cDNA的有效方法。（1）目的基因为平端时，5’CTGCA↓GpstI核酸外切酶或PstⅠ消化生成3’—OH的单链末端，在TdT末端转移酶作用下生成同聚尾dC；(3’G↑ACGTC

（2）载体PstⅠ内切生成3’粘端，TdT作用下加上同聚尾dG；（3）目的基因/载体混火退火生成cDNA，其末端间隙导入宿主中可自行修复。（4）rDNA中cDNA两端各形成一个PstⅠ位点，便于cDNA切出（克隆）。第12页，共15页。5.T载体（A/T克隆法）在克隆PCR产物cDNA时可采用这一方法。（1）cDNA末端添加AA利用Taqpol延伸活性，以不依赖模板的方式在已完成延伸的PCR产物的3’端添加AA（利用DNApol活性可成）。（2）末端为TT的线性化的T载体可用下述4种方法得到：

①MbcⅡ、XcmⅠ或HphⅠ酶切产生单个T突出末端；②用TdT将T加到酶切产生的平端的载体上；③利用Taqpol的延伸活性，为了得到TT，在模板上先加上AA；④T载体已商品化、买。第13页，共15页。二、重组DNA（rDNA）导入受体细胞（一）序言1.导入目的

（1）克隆扩增

rDNA导入宿主细胞，利用宿主的生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）一起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。（2）克隆表达

利用宿主的生理条件，生产基因工程产品或开展基因治疗。受体细胞接受rDNA分子称作受体细胞或宿主细胞有2种（1）原核细胞既可以复制扩增，也可以基因表达。（2）真核细胞一般只用作基因表达系统。2.受体细胞的基本条件

(1)易接纳rDNA分子；(2)对载体复制扩增无严格限制；(3)不降解，不修饰外源DNA分子。3.转化和转染（transformation/transfection）注：transformation质粒导入细菌的过程；

transfection噬菌体，病毒或以它作为