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文档简介
细胞组分的分级分离主要过程:匀浆、差速离心、分析。匀浆:低温条件下,在等渗介质中,制成各种细胞器的混合液。差速离心:在均一介质中,由低速到高速逐级离心,使细胞器按照比重从大到小逐渐沉降的方法。分析:用细胞化学和生物化学方法进行定量和定性检测。实验原理细胞分级分离(cellfractionation):细胞内各种结构的比重和大小等都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同介质和不同转速的离心,将细胞各种组分分级分离出来。离心技术:是分离细胞器(如细胞核、线粒体、高尔基体)及各种大分子基本手段。转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25kr/min,离心力>89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min,离心力超过500Kg。颗粒直径离心机机型转速103nm低速离心机8000转/分102~104nm高速离心机8000~25000转/分102nm超速离心机25000~80000转/分分离方法差速离心分离法:利用不同离心速度产生的不同离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心分离法:将要分离的细胞组分铺放在密度逐渐增加的介质表面,在超速离心力的作用下,不同的组分以不同的沉降速率沉降,形成不同的沉降带。特点:介质密度均一;速度由低向高,逐级离心。用途:分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序:核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离,常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。差速离心Differentialcentrifugation差速离心法differentialcentrifugation匀浆离心1000G20分钟细胞核离心15000G120分钟离心0.26%脱氧胆酸钠15000G20分钟核糖体等离心20分钟10000G微粒体线粒体等小白鼠脱臼处死,迅速开腹,取出肝脏,剪成大块,冲洗一半肝组织,0.25M蔗糖洗3次,加3ml0.25M蔗糖,剪碎匀浆(5-8次),6层纱布过滤至10ml离心管取出1ml至dorf管(A),3000rpm,10min上清入dorf管(B)沉淀加入1ml1M蔗糖,悬3800rpm,10min弃上清,沉淀加少量0.25M蔗糖,悬涂片1涂片2涂片312000rpm,20min弃上清,沉淀加1ml0.25M蔗糖,悬12000rpm,20min沉淀上清加0.25M蔗糖,悬涂片5涂片4涂片1,2,3(晾干)95%乙醇固定5min,晾干甲基绿-哌罗宁染色20min,冲洗丙酮分色,沾2-3次冲洗,晾干,观察1.染核酸涂片4,5(晾干)詹纳斯绿B染色15min冲洗,晾干,观察2.染线粒体作业:1.比较分离细胞核的3张涂片有何不同,为什么?2.比较分离线粒体的2张涂片有何不同,为什么?涂片1,2,3(晾干)95%乙醇固定5min,晾干甲基绿-哌罗宁染色20min,冲洗涂片1,2,3(晾干)丙酮分色,沾2-3次冲洗,晾干,观察95%乙醇固定5min,晾干涂片1,2,3(晾干)
线粒体正常情况下一般呈圆形,饥饿时,缺乏供能营养物质,线粒体会数目减少,大量的嵴会消失,会使线粒体形状变得细长,因而易于观察。线粒体含量较多;长度适合观察,约5μm;肝脏较软,易于破碎,并且适于快速提取,因而利于保持线粒体活性。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色
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