细胞生物学实验课件：细胞组分的分级分离

细胞组分的分级分离主要过程：匀浆、差速离心、分析。匀浆：低温条件下，在等渗介质中，制成各种细胞器的混合液。差速离心：在均一介质中，由低速到高速逐级离心，使细胞器按照比重从大到小逐渐沉降的方法。分析：用细胞化学和生物化学方法进行定量和定性检测。实验原理细胞分级分离(cellfractionation)：细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分级分离出来。离心技术：是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。颗粒直径离心机机型转速103nm低速离心机8000转/分102~104nm高速离心机8000~25000转/分102nm超速离心机25000~80000转/分分离方法差速离心分离法：利用不同离心速度产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心分离法：将要分离的细胞组分铺放在密度逐渐增加的介质表面，在超速离心力的作用下，不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。差速离心Differentialcentrifugation差速离心法differentialcentrifugation匀浆离心1000G20分钟细胞核离心15000G120分钟离心0.26%脱氧胆酸钠15000G20分钟核糖体等离心20分钟10000G微粒体线粒体等小白鼠脱臼处死，迅速开腹，取出肝脏，剪成大块，冲洗一半肝组织，0.25M蔗糖洗3次，加3ml0.25M蔗糖，剪碎匀浆（5-8次），6层纱布过滤至10ml离心管取出1ml至dorf管（A），3000rpm，10min上清入dorf管(B)沉淀加入1ml1M蔗糖，悬3800rpm,10min弃上清，沉淀加少量0.25M蔗糖，悬涂片1涂片2涂片312000rpm,20min弃上清，沉淀加1ml0.25M蔗糖，悬12000rpm,20min沉淀上清加0.25M蔗糖，悬涂片5涂片4涂片1，2，3(晾干）95%乙醇固定5min，晾干甲基绿-哌罗宁染色20min，冲洗丙酮分色，沾2-3次冲洗，晾干，观察1.染核酸涂片4，5（晾干）詹纳斯绿B染色15min冲洗，晾干，观察2.染线粒体作业：1.比较分离细胞核的3张涂片有何不同，为什么？2.比较分离线粒体的2张涂片有何不同，为什么？涂片1，2，3(晾干）95%乙醇固定5min，晾干甲基绿-哌罗宁染色20min，冲洗涂片1，2，3(晾干）丙酮分色，沾2-3次冲洗，晾干，观察95%乙醇固定5min，晾干涂片1，2，3(晾干）

线粒体正常情况下一般呈圆形，饥饿时，缺乏供能营养物质，线粒体会数目减少，大量的嵴会消失，会使线粒体形状变得细长，因而易于观察。线粒体含量较多；长度适合观察，约5μm；肝脏较软，易于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色