基础生物学实验（三）：实验4 植物有丝分裂的孚尔根(Feulgen)核染色观察

实验四植物有丝分裂的孚尔根(Feulgen)核染色观察实验目的掌握孚尔根核染色的方法。了解孚尔根染色的原理。有丝分裂实验原理浮尔根染色法是鉴别细胞中DNA的组织化学方法.DNA—１ＮHCl,60OC水解,部分地破坏核糖与嘌呤之间的糖苷键—嘌呤碱脱掉—核糖的C1上的醛基呈游离态—与Schiff试剂的无色亚硫酸品红分子反应——呈现为紫红色的化合物。酸解使DNA醛基暴露醛基与Schiff试剂发生显色反应1NHCl60℃孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好，易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻）效果较差。在切片、涂片上研究核和染色体时，能减少细胞质着色对观察的影响。在细胞学研究中普遍采用Schiff试剂的组成及配制Schiff试剂：即无色亚硫酸品红。配制方法：溶解1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸水中，轻轻摇动，继续煮5min使其完全溶解，冷却至55-50℃时过滤到棕色带塞子的玻璃瓶中，加入1NHCl20ml，继续冷却至25℃左右，再加入1g偏重亚硫酸钠，摇动使之溶解，置黑暗低温处或冰箱内18-24小时后检查，试剂如透明无色或淡黄色即可使用。漂洗液——200ml水+10ml1MHCl+1g偏亚硫酸钾（钠）材料：大蒜根尖、洋葱根尖1mol/L盐酸(常温和60℃)Schiff试剂45%醋酸或亮绿固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态结构的一种手段。实验步骤固定的目的迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前状态。使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便于鉴定、观察。使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。固定液简单固定液：如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。混合固定液：如Carnoy’s固定液、AF液（乙醇:甲醛=9:1)Carnoy’s固定液Carnoy’s固定液：冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6改良Carnoy’s固定液：冰醋酸:无水乙醇=1:3预处理的目的及方法目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。方法：0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。对二氯苯饱和溶液3-5小时。0.002M(或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以上，室温。低温：1-4℃处理24小时。1、取材:每人1-2个根尖置于eppendorf管——dH2O洗2-3次——1NHCl，室温2分钟。2、水解:倒掉HCL，换入60O预热的HCl——60O水浴10’。去掉热HCl，再换冷HCl，1分钟，——蒸馏水洗2次3、染色:吸净水分，加入Schiff试剂,盖上盖子，暗处染色30’——漂洗液漂洗2次，2分钟/次4、取根尖置于载玻片上，用镊子夹碎后，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。分组：6人一组

HEXIUNIVERSITY根冠分生区伸长区成熟区根尖形态与结构注意事项Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂的吸管。黑暗条件下染色。实验作业绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。前期、中期、后期、末期思考题为什么要严格掌握DNA的水解条件？为什么实验材料从60℃盐酸中倒出后，还要放入室温的盐酸中呢？为什么RNA在此过程中不会着色？为什么要严格掌握DNA的水解条件？温度过低，时间过短：则DNA的水解不够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。温度过高，时间过长：则DNA过度水解，游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成染色浅或不均一。

材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff试剂分解。为什么要在实验材料从60℃盐