考研-分子生物学课件重点

第二章与（cmsm）是细胞在有丝时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。真核生物的在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色(chromatin)的形式存在的小体cleosome成串排列而成的。原核生物(prokaryote)：DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。由DNA和蛋白质组蛋白质由非组蛋白和组蛋白DNA和组蛋白构成核小体。组蛋白的一般特性：P24①进化上的保②无组织特异③肽链氨基酸分布的不对称性：碱性氨基酸集中分布在N端的半条④组蛋白的可修饰性:甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等⑤H5组蛋白的特殊性：富含赖氨酸（24%）(鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5)组蛋白的在细胞周期特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。H3、H4修饰作用较普遍，H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。荷。这些组蛋白修饰的意义：一是改变的结构直接影响转接触，从而间接影响转录活性。2、DNA的变性和复变性（Denaturation)DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程称为变性。增色效应(Hyperchromaticeffect)在变性过程中，260nm紫外线吸收值先缓慢上升，当达到某一温度时骤然上升，称为增色效应。融解温度（Meltingtemperature，Tm) 增加的中点称为融解温度。生理条件下为85-95℃影响因素：G+C含量，pH值，离子强度复性（Renaturation)热变性的DNA 随着DNA的复性，260nm紫外线吸收值降低的现象。C值反常现象（C-valueparadox)C值是一种生物的单倍体DNA的总量真核细胞组的最大特点是它的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非DNA所隔开，这就是著名（四）核小体(nucleosome)：用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核[（H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚体】构成的。1、原核生物组结构特点●组很小，大多只有一条结构简炼存在转录单元(trnascriptional多顺反子由内、部分、一个碱基组成2、真核生物组结构特真核组结构庞大3×109bp、染色质、核单顺反 外显子(exon)非编码区较多多于编码序列重复序不重复序列单一序列：在组中有一个或几个拷贝。真核生物的大多数在单倍体中都是单拷贝的蛋清蛋白、血红蛋白等功能：主要是编码蛋白质。中度重复序列：在组中的拷贝数为101～104。如：rRNA、一般是不编码蛋白质的序列，在调控表达中起重要作高度DNA：A·T1、DNA的一级结构4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，DNA序列是这一概念的简称。碱基序列2）特征双链反向平行配对而脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C：G2、DNA的二级结构：指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产螺旋结构2）分类右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA3、DNA的高级结构：指DNA双螺旋进一步盘绕所形成的特定空间结构。是一种比双螺旋更次的空间构象。2）主要形式：超螺旋结构（正超螺旋和负超螺旋（一）DNA的半保留（semi-nservative1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种方式称半保留。代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。（二）与DNA有关的物1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作4、引物合成酶（酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段聚合酶。5DNA聚合酶:DNA为模板的DNA合成以四种脱氧核苷酸三磷酸为底反应需要有模板的指反应需要有3-OHDNA53性聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶 5外切活+++ 3外切活+--5'3'聚合活性++很低+很高新生链合成--+聚合酶Ⅰ主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA时切除引物并填补其留下的聚合酶Ⅱ修复紫外光引起的DNA聚合酶ⅢDNA的主要聚合酶，还具有3→5’外切酶的校对功能，提高DNA的保真性6、DNA连接酶（1967年发现：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷二酯键，而使切口连接但是它不能将两条游离的DNADNA连接酶在DNA、损伤修复、重组等过程中起重要作7、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超ε白拓扑异构酶Ⅱ：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase)：通ATP获得能量来DNAE.colirep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白3’5’移动，而解螺旋I、II、III53’移动。9、单链结合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：稳定已被解开的DNA单链，复性和保护单链不被核酸酶降解。（三）DNA的过程（大肠杆菌为例双链的解RNA引物的合DNA链的延切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA1双链的解开------ftju制有特定的起始位点叫做原点。ori(o、富含A、T的区段从原点到终点，组成一个单位，叫时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为叉双链解开、起始20DnaA蛋白ATP的作用下与oriC49bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna起始复合物使3个直接重复序列变性,解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开双2、RNADnaB蛋白活化引物合成酶，RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸，3、DNA链的延故称半不连续。在DNA时，合成方向与叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链合成方向与叉移动的方向相形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。在DNA过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。4、切RNA引物，填补缺口，连接相DNA片段（终止）当叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列（Ter）时，Ter-TusDNARNA留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链（四）的几种主要方式 1、双链环状、θ型、双向等速2、滚模板链和新合成的链分开不需RNA引物，在正链3‗－OH上延只有一个叉3、D环---单向的特殊方式如：动物线粒体（五）真核生物中DNA的特1、真核生物每条上有多个起点，多子（约150bp左；2、叉移动的速度较慢（约50bp／秒仅为原核生物的1／103真核生物在全部完之前,各个起始点不再重新开始；真核生物快速生长时，往往采用的起点4、真核生物有多种DNA聚合酶5、真核生物DNA过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核（真核冈崎片段长约100-200bp，原核冈崎片段长约（六）原核和真核生物DNA的特点比①起点（ori：原核一个，真核多个②子：原核一个③子长度：原核长；真核短续开始新的DNA⑦原核生物的与细胞同步，可以多次；真核生物的发生在S期，是细胞分类的特定时期，而且仅此一次。四、DNADNA修复系功错配修复恢复错配碱基切除修切除突变的碱核甘酸切除修修复被破坏的DNA直接修SOS修复嘧啶二体或甲基化DNA的修复，导致变1、错配修复（mismatchDam甲基化酶使母链位于5‘GATC甲基化紧随在DNA之后进行（几秒种后至几分钟内根据叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基2、碱基切除修复excision它能特意切除受损核苷酸上的Nβ糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配3、核通过特异的核酸内切酶识别损伤部由酶的复合物在损伤的两边切除几个核DNA聚合酶以母链为模板合成新子DNA连接酶将切口补4、DNA在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对SOS反应(SOSresponse)：是细胞DNA受到损伤或系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施。包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞也与SOS反应有关。两个作用（1）DNA（2）五、DNA的转座DNA的转座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposableelement)介导的遗传物质重排现象。转座子（transposonTn：存在于DNA上可自主和位移的基本单位。已经发现转座拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA。原核生物转座子的类型1、插入序列IS是最简单的转座子，不含有任何宿主，它们是细菌或质粒DNA的正常组成部分。2、复合转座子(composite复合转座子是一类带有某些抗药性（或其他宿主）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列3、TnATA没有IS序列、体积庞大500p以上、带有3个基因，其中一个编码β内酰胺酶AmR)，另两个则是转座作用所必须的。(三）转座作转座时发生的插入作用的普遍特征，是受体分子中有一段很短的3～l2、被称为靶序列的DNA会被，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。对于一个特定的转座子来说，它所的靶序列长度是一样的如I1两翼总有9T35p的靶序列。靶序列的可能于特定内切酶所造成的黏性DNA末端（三）转座作用的遗传学效应转座引起插入突变（）转座产生新的（3）转座产生的染色体畸变（）转座引起的生物进化反转录转座子（etotrasposo：指通过RNA为中介，反转DNA后进行转第三章生物信息的传递（上）——从DNA转录(transcription)：生物体以DNA为模板合成RNA的过程参与转录的物原料NTP(ATP,UTP,GTP,模板酶RNA聚合酶其他蛋白质因RNA合成方向：5'到转录RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。mRNA序列DNA链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。二、参与转录起始的关键酶与元（一）RNA聚合原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）---全酶=酶+σ因亚基相对分子数组功α2酶酶组装启动子识别β1酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心1酶ω？ 查）1酶？σ1σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的动子真核细胞的三种RNA酶位转录产物相对性对α-鹅膏蕈的敏感性 合酶核50-不敏 合酶核20-敏 合酶核存在物种特异RNADNARNA聚合酶DNA聚合酶大小大引无有产较短，游离氢键相连作用方式一条两条链同时进外切酶活性无 3‘，校对合成能力无有修复能力无有（二）启动子定义：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动转录的一DNA序列。TATA区：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。真核生物启动子的结构启动子（core定义：指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常最少的序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA2、上包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）（三）转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元（原核）三、转录1、起始位点的识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。RNA聚合酶全酶(2)2、转①RNA聚合酶全酶(2)DNA双链解RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物5-pppG- NTP 5-pppGpN-OH3+转录起始复合物RNApol2DNApppGpNOH33、RNA链的延伸亚基脱落，RNA–pol聚合酶酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长注意：9个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。4、转终止子（erminato：位于的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约6-20bp:由一段特定序列5′－AATAAA－3′和回文序列（反向重复序列）组成。分为两类：强终止子－内部终止子：不依赖Rho(ρ)弱终止子－需要ρ因子（rhofactorρ（Rho-dependentterminator）不依赖因子的终止RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡，DNA恢复成双链状态RNARNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。终止位点上游一般存GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。依赖因子的终止因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。（二、真核生物的转转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂（1）.转录起始前的上顺式作用元件(cis-actingelement)：影响自身表达活性的编码DNA序列。例：启动子、增强子、弱化子增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向3.4.5.6.有相位性；7.（2）.DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子rasacigacors。反式作用因子中，直接或间接结合RA聚合酶的，则称为转录因子rascripioalacors,T)。参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接需依靠众多的转录因子。模板理论(piecing结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的。转录延伸转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象转录终止——和转录后修饰密切相关。四、转录后加工5‘端加帽、3‘端加尾、RNA的剪接、RNA的编15‘5‘端的一个核苷酸总7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp。端的这种结构称为帽子（cap。帽子结构功能：①能被核糖体小亚基识别，促使mRNA②m7Gppp结构能mRNA5‘末端mRNA免受5‘核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。2、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---★准确切加poly（A）多聚腺苷酸尾巴功能：提高了mRNA在细胞质中的稳定性3、RNA的剪生物体内U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内参与RNA剪接的物质：snRNA（核内小分子RNA、snRNP（与snRNA结合的白）、核内RNA（U1、U2、U4、U5、U6）4、RNA的编辑 编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。五、原核生物与真核生物mRNA的特1、原核生物mRNA的特半衰期短单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA。多顺反子mRNA：编码多个蛋白质的mRNA。Z：β-半乳糖苷酶Y：透过酶A：乙酰基转移酶ZYA为结构5‘端无帽子‖结构，3‘端没有或只有poly（A）结构SD序列：原核生物起始子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SDmRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。2、真核生物mRNA的特‖的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。5‘端存在帽子‖mRNA3‘端具poly（A）尾巴（组蛋白除外以单顺反子的形式存六、RNA合成DNA合成异同点相同点：1、都以DNA链作为模2、合成的方向均为3聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3‘,5‘-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。不同点：转模两条链均模板链转（不对称转录原酶DNA聚合酶RNA聚合酶产子代双链mRNA，（半保留配A-T；G-A-U；T-A；G-引RNA引物无第四章生物信息的传递（下）—mRNA到蛋白翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是核糖体。蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是tRNA蛋白质合成的原料是20种氨基酸一、遗传¡ª¡ª三联子（一）三联子：mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为子或三联子(tripletcoden)。至1966年，20种氨基酸对应的61个子和三个终止子全部被查清。（三）遗传的性1、连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体连续阅读，间既无间断也无交叉。损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshiftmutation)。从mRNA5端起始子AUG到3端终止子之间的核苷酸序列，各个三联体连续排列编码一个蛋白质多肽链称为开放阅读框架 frame,ORF)。2、简并由一种以上子编码同一个氨基酸的现象称为简（degeneracy，对应于同一氨基酸的子称为同义（synonymouscodon。3、通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套，从原核生物到人类都通用。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。4、摆动性转运氨基酸的tRNA上的反子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传子反向配对结合，在子与 子的配对中，前两对格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆这种现象称为子的摆动性。二、tRNA的结构、功能与种类（一）tRNA的结构1、二级结构：三叶草形2―L（二）tRNA的功能1、解读mRNA2、的工具，运载氨基tRNA有两3‘端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA与mRNA结合部位—反子部tRNA凭借自身的反子与mRNA链上的子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。1、起始tRNA和延伸能特异地识别mRNA模板上起始子的tRNA称起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。真核生起始子AUG所编码的氨基酸是Met，起始AA-为Met-tRNAMet原核生物始子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet2、同工代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA同工tRNA既要有不同的反子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA合成酶识别（P119。3、校正无义突变校正tRNA：可以通过改变反子区校正无义突错义突变校正tRNA：通过反子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。无义突在蛋白质的结构一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的子变成终止子（UA、UGA、UAA，使蛋无义突变。 中某个核甘酸的变化使一种氨基酸一性三、核糖体的结构与功rRNA（riosomalriocleicaci）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖白颗粒蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。细菌是 哺乳动物是（二）核糖体的功能：合成蛋白质有专一的识别作用和功能。mRNA结合部位——小亚结合或接受AA-tRNA部位（A位）——大亚结合或接受肽基tRNA的部位——大亚肽基转移部位（P位）——大亚形成肽键的部位（转肽酶中心）——四、蛋白质合成的过程(生物学机制氨基酸的活翻译的起肽链的延肽链的终蛋白质前体的加工(一)氨基酸原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸起始AA-tRNA是：Met-(二)翻译的起翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步：1.白体大小亚基分2、30S小亚SD序列与mRNA模板在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的PtRNA上的反子与mRNA上的起始子配对4、带有tRNA、mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。真核生物翻译起始的特点核糖体较大,为mRNA5′端具有m7Gppp帽子结Met-mRNA5′端帽子结构和3polyA都参与形成翻译起始复合物；真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物（P131(三)肽链的延环包括：AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。延伸因子(elongationfactorEF)原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)、EF-真核生物：EF-1、EF-1AA-tRNA与核糖体A位点的结合需要消耗GTP，并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子2、肽键形成：是由转肽酶/肽基转移酶催3、移位：核糖体向mN‘端方向移动一个子。需要消耗GT，并需EG延伸因子A位点是新到来的氨酰-tRNAP位点是肽酰tRNA助肽链的释

RF3GTP酶活性，刺激RF1RF2活性，真核生物只有一个终止因子(五)蛋白质前体的加1、NfMetMet的切2、二3、特定氨基酸的修磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化4、切除新生肽链中非功能片（六）蛋由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三位构象，从而表现出生物学活性或功能。新生多肽→一级结构→二级结构→三级结构已经具有活性→（对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性。(七)蛋白质合成抑制类医学。氯霉素有时也用于治病，但剂量和周期受到较严控制。五、蛋白1、翻译-2、翻(1)线粒体蛋白质跨膜运转(2)叶绿体蛋白质的跨膜运转4、蛋¶*蛋白质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需要运转。*充和更新细胞功能。¶*细胞各部分都有特定的蛋白质组蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。¶*细胞中蛋白质的大多数在细胞质中合成；一小部分在细胞器（叶绿体和线粒体）中合成。¶*定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质胞器内合成的留在细胞器内。¶*蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转（proteintraslocation蛋白质运翻译-运转同步（co-translational蛋白质正合成的时候就可与运转装置结蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membrane-boundribosome分泌蛋白质大多是以同步机制翻译后运转（post-translational转装置结合。后运转机制的。内。运转机制主要类型分蛋白质在结合核翻译-运转同步机制免疫球蛋白、白、水解酶、激素发育蛋白质在游离核译后运转机制运化物酶体等细胞器中的蛋白质两种机制兼中的蛋白1、翻译-运转同步机制信号肽假说信号肽：能启动蛋白质运转的任何一段（常指新合中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在端绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都信号序列特点：一般带有10-15个疏水氨基酸在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸。蛋白质合成起始首先合SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合信号肽进入膜蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进信号肽与蛋白质转运的关系P144完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发信号序列切除并不是转运所必需蛋白质翻译运转同步的基本过程可分两个阶段首先：带有新生肽链的核糖体与膜结合；然后：新生肽链进入膜通道并易位。核糖体与膜结合需要信号识别颗粒（signalrecognitionparticle,SRP。SRP有两种SRP受体2、翻译后运转机制前导肽及其特性:ﻇ翻译后跨膜易位的蛋白质，前体一般含前导肽(leaderpeptide)，前导肽在跨膜运转中起重要作用。ﻇ过膜后，前导肽水解，蛋白质变为有功能的蛋白质。前导肽的一般特性：带正电荷碱性氨基酸（Arg）较丰富，分散于不带电荷的酸序列之间缺少带负电荷的酸性氨羟基氨基酸（Ser）含量较有形成两亲（亲水和疏水）α-螺旋能力。线粒体蛋白质跨膜运转Hsp70为分子伴它们折叠或防止它们的蛋白质。(1)帮助新生蛋白质正确折(2)纠正泛素活化酶(ubiquitin-activating泛素结合酶（ubiquitin-conjugating泛素蛋白连接酶(ubiquitinproteinligatingenzymeE3)E1,E2,E3的作用：E1激活泛素分子E2E3能识别被降解的蛋白质第五学研﹡重组DNA技术-工﹡分子杂﹡聚合酶﹡DNA多态性及其检DNA胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及的人工合成、定点突变和CR扩增等。工程：指在体外将核酸分子插入、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。1、理论上的三大发遗传物质主要是DNA的双螺旋结构和半保 机遗传子的破2、技术上的三大发限制酶和连接酶体外切割和连接DNA质粒改造成载体以携带DNA逆转录酶的使用①常用的工具限制性核酸内切酶切割DNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸②载自我克隆载体、表达载体原核载体：质粒B,C…）噬菌体（λ，M13）真核载体：动物体LXSN载体的条件 分子小（10 可自主 有足够的copy 带筛选的标志1982年--转小1997年克隆绵羊多利1998--克隆鼠2001年2月--人类重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是工程GeneEgieerig)的技术。重组A（tA）是人类根据需要选择目的（A片）在体与运载重组转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以 的人工合成、工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。或者说操作技术服务于工程。一、限制酶限制性内切核酸酶srcieeocaes，又称限制酶。是特异性地切断DNA（分子手术刀。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和诊断中重要的一类工具酶。1、限制酶命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如：属 菌株EcoR种 编EcoRI来源于大肠杆菌E.coliRY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。2、限（1）.限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点：①能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配②两条互补链的5‘—3‘的序列组将一条链旋转180度，则两条链。（2）.识别４-8个相连的核苷酸组成的特定切割方式有两①错位切割，产生互补性的粘性末端错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。②沿对称轴切割，产生平齐末端切割后，DNA末端的一条链多出一至几个核苷酸，成为突出末端，又称粘性末端包括3‘突出、5‘突出。切割两条链时产生两端平整的DNA分子具有同裂来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。如：BamHI和BstI具有相同的识别序列GGATCC。具有同尾一种酶所切割如：TaqI、ClaIAccI为一组同尾酶，其中任何一种酶DNA5CG凸出的粘性末端。二、目的及载体（一）目（一）目的的获化学合成法较短的（60-用途：PCR引物、引物、定点突变、核酸杂交探DNA的化学合单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术的常规技术。化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5‘端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。目前常用的化学合成DNA组文库和cDNA文库库，也叫组文库，DNA文库（DNAlibrary)是指用克隆的方法将一种生物的全部组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了组DNA的所有序列。这样保存的组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时以在这样的馆‖中查（没有 cDNA文库首先获得mRNA反转录得cDNA经克隆后形成文库cDAN文库和组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了复杂性比文库低得多。核酸序列直接推倒出来。组建一个cDNA文库的步1)分离表达目的的组织或细6)双链cDNA（二）载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体具以下特征：分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞）被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其能力，并有可选择的标记（如，抗药。4）可以在载体细胞中独立，即本身是一个子。根据载体如：质粒载体（2）.型载体—环状ss-和ds-DNA分子形成颗粒。如：噬菌体载体（）混合型载体具质粒和特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。如：柯斯质粒载体用于原核生物宿主的载体目前已构建应用的工程载体主要有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体。（一）.质粒（plasmid：质粒是细胞或核区DNA外能够自主的很质粒载体特1、至少有一个起点，因而至少可在一种生物体中自主2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入3、至少应有一个遗传标记，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数注：前三个特1、标记的作其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记及其作用机制四环素抗 （Tetr氨苄青霉素抗 （Ampr氯霉素抗性（Cmlr卡那霉素(Kanr新霉素(Neor)G418抗性(G418r)5）β—半乳糖苷酶（lacZ和lacZα）三DNA重组基本程分—载体和目的的分切—限制性内切酶的应接—载体与目的连接成重组转—序列转入细筛—目的序列克隆的筛选和鉴表－目的在宿主细胞的表目的的获取方法：从组中提取、CDNA法、化学合成法PCR法。鉴定得到的目的的鉴定方法：抗性选择、提取质粒电泳鉴定大小、快速提取酶切鉴定、菌落杂交法、DNA序列分析。第二节分子杂交：是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交，DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western杂交）等。一、杂交探针（Probe）的获roe：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光等进行标记后，能与目的片段特异性杂交的已知序列的核酸片段。DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。DNA探针：产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对可以从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的探针RNA探针：所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和RNA探针，这些RNA是在细胞转录或这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。寡核苷酸探针根据已知序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bpRNA探针和cRNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效RNA探针。三、DNA杂交常用的用途快捷地检查出菌落中是否有某个检出的大小或重复的程度。（二）SouthernDNA印迹杂离，再将其原位转至薄膜上，固定后用探针杂交的方法叫Southern杂交。用途：用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的，而且还可知道其大小及酶切位点的分布。SouthernDNA印迹杂交主要步骤DNA提取，限制性内切酶切割成DNA片段DNA电泳。印迹DNA电泳的凝胶置于印迹设备中，缓冲液内含有碱，在印迹过程中DNA变性，变成单链DNA。凝胶上的DNA分子通过毛细管作用或电导作用被原封不动地吸印‖到滤膜上。80℃烘烤1-2小时，DNA片段牢固结合到膜上去没有结合的游离探针。用X光底片后所得的放射性自显影，同溴化乙锭染色（三）.菌落印迹原位杂交(insitu让含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到膜上并释放出DNA，变性并固定在膜上，再同DNA探针杂交的方法叫原位杂交。用途：用于在转化菌落中筛选带有目的的重组克隆四、RNA杂交常用方法NorernRNA印迹杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维被检对象为RNA探针为DNA或RNA.用途：用来检查组中某个特定的是否得到转录原理RNA、提纯分离mRNA、琼脂糖凝胶电泳分离RNA、转移至硝酸纤维素膜、杂交检测关于印迹印迹是将DNA、RNA或蛋白质固定在固体支持物的过程otern杂交、Norern杂交和Wesrn印迹、Easern印迹实五、蛋白质印迹法（Wesernloig)Westernblotting分析是蛋白质分析的技术在表达研究中，应用非常广泛，因为蛋白质是的产物，研究蛋白质的变化来分析判断转录的高与低。步骤：细胞→提取总蛋白质→聚丙烯酰胺凝胶电泳→转膜第三节聚合酶链式反应（polymerasechainPCR是模拟体内DNA条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术PC（boosterPCR2.PC（estPCR3PCR4、逆转录PCR(retro-transcriptionPCRRTPCR)5.不对称PCR6.反向PCR7、锚定PCR（AnchoredPCR,A-PCR）先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3‘-可变区末端加上一个PolyG尾巴，所用引物是具5‘-polyC尾巴，可以与PolyG尾合，是一个固定点，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，由此进行PCR扩增，叫锚定PCR。锚定PCR主要用于分析具有可变末端的DNA序列PCR技术的应1.遗传性疾病的诊断2.传染病的诊断(肝炎)3.癌检测4.法医学(亲子鉴定)上的应用5.DNA6.克隆7.引入点突变,融合等第四DNA多态性（DNAPolymorphism群体中每个（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100～500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称DNA多态。常用做遗传分析中的标记。除一卵双生子外没有两个的组DNA是完全相同的。DNA多态性有两类：位点多态性：是由于等位之间在特定的位上NA序列存在差异，也是组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换，单个碱基的置换、缺失和插入。突变是多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性siglecleoieolymorhism,N)。序列长度多态性：又称可变数目变异串联重复序列（varialemerofanem,VNTRS的尾相连多次重复，散在地分布于上，以插入缺失方式形成多态。VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。PCR-SSCP(Single-StrandedConformationSSCP：单链构象多态是指单DNA由于碱基序列不同而引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单DNA电泳迁移率不同。据此，可用DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。，又称生物，DNA，DNA探针微阵列（Microarray。集了的集的针些针于的原理确定靶的核酸序列的分子识别能在同一时间内分析大量的，实现生物信息的大规模检测。组扫描寻找功型及单碱基多态突变检表达药物筛几乎所有的生物学研究领域作为一种高通量的方法巨大的应用潜力。第六章原核生物表达调一、表达(geneexpression)：在一定调节机制控制下，通过转录和翻译而产生其蛋白质产物，或转录后直接产生其RNA产物，如tRNA、rRNA等的过程。大多数的表达产物是蛋白质,部分如RNA和rRNA基因表达产物是RNA。二、表达调围绕表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为表达调控.转录水平的调转录后的调翻译水平的调DNA水平包括丢失、重排、染色质的结构状态RNA水平包括转录水平调控、RNA的转录后加工、mRNA从核内向胞浆转动、mRNA稳定性。三、表达的特性：空间特异性或组织细胞1、时间特异为表达的时间特异性(temporalpecificity)。多细胞生物表达的时间特异性又称阶段特异性(stagespecificity)2、空间特异性（spatial在生长全过程，某种产物在按不同组织空间顺序出现，称之为表达的空间特异性(spatialspecificity)。表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性cellorisseseciiciy)。四、 表适应性表达（诱导和阻遏表达1、组表指不大受环境变动而变化的一类的表达。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代谢过程中十分必须的蛋白质或酶的表达。某些在一个生物的几乎所有细胞中持续表达通常被称为管家oseeegee管蛋白糖酵解酶系、核糖体蛋白等。2、适应性表达（诱导和阻遏表达指环境的变化容易使其表达水平变动的一类表达诱导表（induction指在特定环境因素刺激下，被激活，从而使的表达产物增加。这类称为可诱导。阻遏表（epressio指在特定环境因素刺激被抑制从而使的表达产物减少。这类 称为可阻遏。均需协调一致、共同表达，即为协调表达cooriaeexressio)，这种调节称为协调调节cooriaereglatio。五、表达调控的基本原理1.表达调控的多层次和复杂性四个基本调控点（1）结构的活转录起始：最有效的调转录后加工及翻译及翻译后 转录激活调节基本要物表达的调节与的结构性质，生或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。物三个基本要素特异的DNA调节序调节RNA聚合转录激活调节基本要素1DNA序列原核生物的子真核生物的顺式作用元2、调真核生物的顺式作用元件：是指可影响自身表达活性的特 序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默等2、调是调节转录的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物活化蛋白、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。3RNA聚合酶原核启动序列或真核启动子是由转录起始点、RNA聚合酶结合位点及控制转录的调节组件组成。启动序列影响其与RNA聚合酶的亲和力，而亲和力大小则直接影响转录起动的频率。六、表达调控的生物学意1、适应环境、维持生长和增2、维持发育与分化转录水平上的调控转录后水平上的调控原核生物主要是在转录水平上调控的表达当需要某种产物时，就大量合成这种mRNA，当不需要这种产物时就抑制这种mRNA的转录，就是让相应的不表达。通常所说的不表达，并不是说这个就完全不转录为mRA，而是转录的水平很低，维持在一个基础水平（本底水平。1、负调控negative在没有调节蛋白质存在时是表达的，加入某种调节蛋白质后活性就被关闭，这样的控制系统就叫做负控系统。2、正调控positive在没有调节蛋白质存在时是关闭的，加入某种调节蛋白质后活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控系统。其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白（激活蛋白两种类型:正控（二）特殊代谢物调节表达的类1、可诱导调一些在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使活化。调节分解代谢的子，同时受cAMP-CAP的活性调2、可阻遏调一些在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来开启的状态转变为关闭状态，的表达被阻遏.调节合成代谢的（三）原核生物表达调控的特调节的主要环节在转录水平上进σ因子决定RNA主要通过子模式进行调阻遏蛋白对转录的抑制作用（阻遏机制）作用原核生物中的组织形几个作用相关的在上串连排列在一起，由同一个调控系统来控制。这样的一个整体称为一个元(operon)。二、弱化子对活性的影响1、弱化在区与结构之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，当子被阻遏时，RNA合成被终止，这段核苷酸起终止转录信号用2、弱RNA分子在分子内采用不同的碱基配对方式，形成不同的二级结构而参与调控。当不同的结构对是否允许终止存在差异时，改变二级结构可对转录终止进行调控三、降解物对活性的调1、葡萄糖效应（降解物抑制作用是指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用，葡萄糖的存在了其它糖类的利用的现象。2、降解物对活性的调葡萄糖通过降低cAMP的含量而抑制表达四、细菌的应急反应1、细指细菌在恶劣生长环境中关闭tRNA和核糖2、细菌的应急反应的应急信号鸟苷四磷酸（ppGpp、鸟苷五磷酸诱导物：空载乳 子模1、Z、Y、A的产物为一条多顺反子laZ：编码β糖；lac壁；lacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶，进行乳糖代谢。（CataboliteactivatingproteinCAP的受体蛋白（cyclicAmpreceptorprotein,cAmp-CAP复合物，是lac元的正调控因4、葡萄糖对lac子的影葡萄糖腺苷酸环化酶活性降低ATP无法转变成cAMP不能形成CAP-cAMP复合蛋白RNA酶无法结合在DNA上结构不表达。代谢物阻遏效lacmRNA的合成，这种效应称之为代谢物阻遏效应.特殊代谢物调节活性的类可诱导调节：调节分解代谢的子，同时受cAMP-CAP的活性调节可阻遏调节：调节合成代谢的（三）trp子的阻遏调控机色氨酸子主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。当细胞内缺乏色氨酸时，此子开放，而当细胞内合成的色氨酸过多时，此子被关闭。色氨酸子的调控机制与乳糖子类似，但通常情况下，遏转录。合而形成阻遏蛋白，后者与结合而使转录关闭。（一）弱化在区与结构之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序当子被阻遏时，RNA合成被终止，这段核苷酸起终止转录信号用（四）转mRNA转录的终止是通过前导肽的翻译来调节的导肽中有两个相邻的色氨酸子，故这个前导肽翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。（五）衰减子的生物活性阻遏物和非活性阻遏物的转变可能较慢，而tRNA负载与否可能更为灵敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而以tRNA负载情况为标准来进行控制可能更为恰当.当细胞内氨基酸高于某一水平时，可以实现完全的阻遏；而只有低于这一水平时，才需用衰减子这个调节系统来进行调节，阻遏蛋白和衰减子调节机制都是为了避免浪费，提高效率。第七章真核生物表达调表达 expression)--转录及翻译的过程rRNA、tRNA的合成属于表真核生物表达的调控的水DNA水平的调控转录水平的调控转录后水平的调控翻译水平的调控翻译后水平的调控真核组的结构特1、在真核细胞中，一条成mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多子形式。2、真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是露的。3、高DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的4真核生物能根据生长发育阶段的需要进行DN段重排，还能在需要时增加细胞内某些的拷贝数。、在真核生物中，转录的调节区相对较大，一般通过改变整个所控制5上游区NA构型来影响它与NA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑NA聚合酶与它的结合。、真核生物的NA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达7、许多真核生物的只有经过复杂的成熟和剪接过程才能顺利地翻译成蛋白质。、