项目模块5：高效液相色谱法简介.中职课件电子教案

项目模块5：高效液相色谱法简介专题项目1：高效液相色谱法基本原理一、高效液相色谱法概述1、高效液相色谱法简介高效液相色谱（HPLC）是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。高效液相色谱法，成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法填料填充，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。2、高效液相色谱发展历史二、高效液相色谱法的特点1、高压；2、高速；3、高效；4、高灵敏度；5、适应范围宽。气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析；高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大的有机物原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。三、高效液相色谱法的主要类型通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。1、液-固吸附色谱法流动相为液体，固定相为剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。液-固吸附色谱法适用于分离相对分子质量中等的油性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。2、液-液分配色谱法及化学键合相色谱流动相和固定相都是液体。从理论上说，流动相与固定相之间应互不相溶，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。在液-液色谱法中，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，这种情况称为正相液-液色谱法。反之，流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液-液色谱法。液-液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果。化学键合固定相，不仅用于反相色谱法、正相色谱法，还用于离子色谱法、离子对色谱法等色谱技术上。其中特别是反相化学键合相色谱法，由于操作系统简单，色谱分离过程稳定，加之分离技术灵活多变，已经成为高效液相色谱法中应用最广泛的一个分支。四、液相色谱法固定相、流动液1、液—液色谱法及离子对色谱法固定相这类固定相是在担体上涂渍一层固定液构成，或使用化学键合相。（1）担体①全多孔型担体；

②表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）。这种担体目前应用较为普遍。（2）固定液液-液色谱固定相采用机械涂制的方法，将固定液涂附在上述担体上，以组成固定相。

（3）化学键合固定相硅胶表面十八烷基键合相硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C)，它的化学键稳定，耐水、耐热、耐有机溶剂，是液相色谱应用广泛的固定相。化学键合固定相的分离机制不是全部吸附过程，亦不是典型的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之。2、液－固吸附色谱法固定相采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。目前较常使用的是5～10μm的硅胶微粒（全多孔型）。3、液相色谱法流动相选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。（1）流动相纯度。一般采用色谱纯试剂，必要时需要进一步纯化，以除去有干扰的杂质。（2）避免流动相与固定相发生作用，使柱效下降或损坏柱子。（3）对试样要有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）溶剂的粘度小些为好。（5）应与检测器相匹配。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。除此之外有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。专题项目2：高效液相色谱仪典型的高效液相色谱仪结构和流程可用如下图所示。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、脱气器、高压输液泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、工作站等主要部件。一、贮液器贮液器用于存放溶剂。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。二、脱气装置为了消除气泡对液相色谱分析结果的影响，在线脱气机接于HPLC的流动相贮液器与高压谱泵之间。三、高压输液泵高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。1、对输液泵的基本要求（1）流量准确可调。（2）耐高压。（3）液流稳定。（4）泵的死体积小，泵的结构材料应耐化学腐蚀。2、高压输液泵的分类输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。其中恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。（1）活塞型往复泵

活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。(2)隔膜型往复泵隔膜型往复泵也是一种恒流泵。单活塞往复泵示意图双活塞往复泵示意图隔膜型往复泵示意图四、梯度洗脱装置1、进行梯度洗脱的原因类似于气相色谱中的程序升温。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

3、梯度洗脱装置

线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。

阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统。高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。五、进样装置进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器。液相色谱进样针类似于气相色谱进样针，只是其针头为平头。

操作时先将阀柄置于采样位置（Load），用平头微量注射器（体积应约为定量管体积的3～5倍）注入样品溶液，样品停留在定量管中，多余的样品溶液从流出通道处溢出。将进样器阀柄顺时针转动60度进样位置（Inject）时，流动相与定量管接通，样品被流动相带到色谱柱中进行分离分析。六、色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。色谱柱的管外都以箭头显著地标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。色谱柱的正确使用和维护：（1）避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。（2）应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。（3）一般说来色谱柱不能反冲，反冲会迅速降低柱效。（4）选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。（5）避免将基质复杂的样品直接注入柱内。（6）经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。（7）保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。（8）色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。一般在色谱柱前要求安装保护柱，可以经常而且方便地更换，起到保护延长分析柱寿命的作用。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4--5天开机冲洗15分钟。七、检测器检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。HPLC检测器应满足下列要求:①具有高灵敏度和可预测的响应；②对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适用范围广；③温度和流动相流速的变化对响应没有影响；④响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱；⑤死体积小，不造成柱外谱带扩展；⑥使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修；⑦响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽；⑧不破坏样品组分；⑨能对被检测的峰提供定性和定量信息；⑩响应时间足够快。1、紫外-可见光检测器紫外-可见光检测器的基本结构与一般紫外-可见光分光光度计是相同的，包括光源、分光系统、试样室和检测系统四大部分。紫外可见吸收检测器光路图2、光电二极管阵列检测器以光电二极管阵列作为检测元件的紫外可见吸收检测器。它可构成多通道并行工作，得到的是时间、光强度和波长的